Praca finansowana ze środków Uniwersytetu Medycznego w Łodzi nr pracy 502-17-858.

WSTĘP

Krótko- czy długotrwała hipokinezja jest w dużym stopniu konsekwencją negatywnych przyzwyczajeń współczesnego człowieka do wygodnego, mało ruchliwego stylu życia. Powszechnym zjawiskiem wśród ludzi starszych staje się ograniczona aktywność ruchowa i utrata niezależności. Hipokinezja jest stanem klinicznym powstałym na skutek ograniczenia aktywności ruchowej. Następstwem hipokinezji są niekorzystne zmiany obejmujące stawy, mięśnie, kości, układ krążenia i serce, układ oddechowy, gospodarkę wodno-elektrolitową. W okresie ograniczonej aktywności ruchowej lub jej braku dochodzi również do zaburzenia równowagi między ustrojowymi procesami utleniania i redukcji, które prowadzą do generacji reaktywnych form tlenu (RFT) i powstania stresu oksydacyjnego [1]. Obrona organizmu przed negatywnymi skutkami działania RFT następuje przy udziale układu antyoksydacyjnego, do którego zalicza się między innymi enzymy antyoksydacyjne: dysmutazę ponadtlenkową (CuZn-SOD) (E.C.1.15.1.1), katalazę (CAT) (E.C.1.11.1.6) i peroksydazę glutationową (GSH-PX) (E.C.1.11.1.9) oraz antyoksydanty niskocząsteczkowe, takie jak zredukowany glutation (GSH), witaminy A i E, melatoninę oraz inne.

Melatonina jest hormonem szyszynki, o dużej aktywności biologicznej, wykazującym między innymi funkcje antyoksydacyjne, neutralizującym rodnik hydroksylowy, anionorodnik ponadtlenkowy, rodniki peroksylowe, nadtlenek wodoru, kwas podchlorawy, tlen singletowy, tlenek azotu, anion peroksynitrytowy, rodnik porfirynowy [2, 3].

Następstwem nadmiernego gromadzenia się RFT i/lub osłabienia układu przeciwutleniającego jest uszkadzanie organelli komórkowych, w których następują zmiany strukturalne i metaboliczne prowadzące do patologii komórkowej w tkankach i narządach. Stan ograniczonej aktywności ruchowej nasila procesy prooksydacyjne i obniża aktywność enzymów przeciwutleniających takich jak dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza,  peroksydaza glutationowa [4, 5, 6]. Działanie antyoksydacyjne melatoniny polega między innymi na zwiększaniu aktywności w/w enzymów [7], stymulowaniu syntezy glutationu [8] i zapobieganiu tworzenia się wolnych rodników w mitochondriach [9, 10].  

Celem pracy była ocena wpływu suplementacji melatoniną na barierę antyoksydacyjną poprzez określenie aktywności dysmutazy ponadtlenkowej (CuZn-SOD) w krwinkach czerwonych pacjentów poddanych krótko- jak i długoterminowej hipokinezji w porównaniu z grupą osób o normalnej aktywności ruchowej.

MATERIAŁ I METODY

Badaniami objęto 15 pacjentów (grupa A – hipokinezja krótkoterminowa) w wieku 71,5±11,5 lat, zakwalifikowanych do zabiegu alloplastyki stawu biodrowego, hospitalizowanych na Oddziale Urazowo-Ortopedycznym Szpitala MSWiA w Łodzi. W większości przypadków choroba zwyrodnieniowa stawu biodrowego miała podłoże idiopatyczne, pourazowe. Wszyscy chorzy przez okres 10 dni przyjmowali preparat melatoniny (5 mg/dobę firmy LEK-AM) na godzinę przed snem.

Drugą grupę badawczą (grupa B – hipokinezja długoterminowa) stanowiło 18 chorych w wieku 58±30,0 lat, cierpiących z powodu stwardnienia rozsianego (10 osób) oraz udaru mózgu (8 osób), rehabilitowanych w Klinice Rehabilitacji III Miejskiego Szpitala w Łodzi. Chorzy poddani zostali badaniu w skali ADL (ang. Activity of Daily Living – Skala Podstawowych Czynności Życia Codziennego) oceniającej ogólny stan sprawności. Średnia ocena wynosiła 5 punktów na 100 możliwych, co świadczyło o zupełnej niesprawności, chorzy byli leżący, samodzielnie nie utrzymywali pozycji siedzącej.

Suplementacja drugiej grupy pacjentów melatoniną o dawce 5 mg/dobę trwała przez 30 dni, podawana w godzinach wieczornych.

W badaniach również wzięło udział 17 pacjentów Kliniki Chirurgii Miękkiej o normalnej aktywności ruchowej, którzy stanowili grupę odniesienia (grupa C).

Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej UM w Łodzi.

Materiałem do badań była krew pełna, którą pobierano systemem próżniowym jednorazowego użytku w ilości 6 cm3 do probówek polietylenowych z heparyną litową.

Oznaczenia badań biochemicznych wykonano w dniu przyjęcia chorego do szpitala i podania melatoniny oraz po 10 dobach (grupa A) oraz po 30 dniach (grupa B) przyjmowania melatoniny.

Krew wirowano przez 10 min. przy 3000 obr/min. Osocze usuwano, a masę erytrocytarną przemywano 3-krotnie zimnym (+40C) 0,9% roztworem NaCl, zachowując te same warunki wirowania. Po usunięciu nadsączu, przemyte erytrocyty hemolizowano poprzez zmieszanie z równą ilością wody redestylowanej i zamrożenie w temp. -180C.

Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (CuZn-SOD) w krwinkach czerwonych oznaczano metodą Misry i Fridovicha [11]. Stężenie hemoglobiny (Hb) w hemolizatach krwi oznaczono standardową metodą Drabkina, jako parametr niezbędny do obliczeń aktywności badanego enzymu.

Wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Obliczeń statystycznych dokonano z wykorzystaniem testu Manna-Whitneya i testu Wilcoxona. Wyniki uznano za znamienne, gdy p<0,05.

WYNIKI

U pacjentów poddanych alloplastyce stawu biodrowego (grupa A), w pierwszym dniu podania melatoniny (A1) aktywność CuZn-SOD wynosiła średnio 2224,2±411 U/g Hb, w 10 dobie po zabiegu i przyjmowania hormonu (A2) aktywność enzymu nieznacznie wzrosła i wynosiła średnio 2292,6±650 U/g Hb.

U chorych z długotrwałym ograniczeniem ruchowym (grupa B), w pierwszej dobie przyjmowania melatoniny (B1) aktywność CuZn-SOD wynosiła średnio 2066,7±268 U/gHb, po 30-dniowej suplementacji (B2) aktywność enzymu wzrosła i wynosiła średnio 2548,3±447 U/g Hb.

W grupie odniesienia (C) poziom aktywności dysmutazy ponadtlenkowej w krwinkach czerwonych wynosił średnio 2500,6±367 U/g Hb.

Istotna statystycznie (p<0,05) różnica wystąpiła w grupie osób z normalną aktywnością ruchową (C) w odniesieniu do otrzymanych wyników dla obydwu grup chorych w pierwszym badanym okresie czasowym (A1 i B1). Różnica aktywności CuZn-SOD osiągnęła także znamienność statystyczną pomiędzy pierwszą (A2) a drugą grupą pacjentów (B2) w drugim okresie badawczym.

Po 30 dniach suplementacji wykazano znamienny statystycznie wzrost aktywności enzymu dysmutazy ponadtlenkowej w grupie osób z długotrwałym ograniczeniem ruchowym (p<0,05). Uzyskane wyniki przedstawiono w tab. I.

DYSKUSJA

W wyniku operacyjnego leczenia zwyrodnienia stawu biodrowego, poprzez wymianę na endoprotezę, u chorego dochodzi do naruszenia ochronnej bariery antyoksydacyjnej i związanej z tym destrukcji tkanek. W badaniach własnych zaobserwowano, iż reakcją na uraz, obok licznych procesów o charakterze obronno-adaptacyjnym, jest zaburzenie homeostazy prooksydacyjno-antyoksydacyjnej organizmu, które prowadzi do podwyższenia stężenia reaktywnych form tlenu i nasilenia stresu oksydacyjnego [12, 13, 14]. Reaktywne formy tlenu, do których należą anionorodnik ponadtlenkowy, rodnik hydroksylowy, nadtlenek wodoru, nadtlenoazotyn, czy rodniki organiczne, reagując z komórkowymi cząsteczkami, wywołują zmiany ich struktury, a nawet degenerację czy apoptozę komórek.

Również długoterminowe ograniczenie aktywności ruchowej znacznie osłabia system obrony przed szkodliwymi RFT. Długotrwałe unieruchomienie w łóżku zmniejsza wydolność fizyczną i powoduje zmiany zanikowe w układzie mięśniowo-szkieletowym, a zachodzące zmiany w tkance kostnej prowadzą do atrofii kości. Osteomalacja i osteoporoza to dwa procesy współdziałające w ilościowej i jakościowej degradacji kości. Osteoporoza wynika z zaburzeń formowania macierzy kolagenowej w następstwie zwiększonej aktywności osteoklastów, która spowalnia kształtowanie się kości. Badania z końca lat dziewięćdziesiątych XX wieku w doświadczeniu na szczurach dowiodły, że ograniczenie czynności ruchowej przez okres 90 dni prowadzi do rozwoju osteoporozy i zmian strukturalnych kości [15]. Wyniki kolejnych badań przemawiają za tym, że melatonina odgrywa istotną rolę w regulacji procesu modelowania strukturalnego i/lub przebudowy oraz mineralizacji kości [16].

Prace doświadczalne wskazują, że melatonina bierze udział w regulacji metabolizmu wapnia i fosforu poprzez pobudzanie przytarczyc, hamowanie uwalniania kalcytoniny i supresję syntezy prostaglandyn – znaczących regulatorów gospodarki wapniowo-fosforanowej i związanego z nią metabolizmu kostnego [17].

Następstwem łatwej rozpuszczalności melatoniny, zarówno w tłuszczach, jak i w wodzie, jest jej pełniona rola przeciwutleniacza zarówno hydrofilowego oraz hydrofobowego. Dowiedziono, że melatonina jest 5-krotnie silniejszym antyoksydantem usuwającym rodniki wodorotlenowe niż główny przeciwutleniacz hydrofilowy – glutation. Stężenie wewnątrzkomórkowe melatoniny jest często wyższe niż stężenie w płynach ustrojowych. Jej łatwa dostępność w komórce, mimo występowania w organizmie w znacznie niższym stężeniu niż na przykład glutation, sprawia, że melatonina może być uznawana za jeden z najistotniejszych antyoksydantów [18].

Z piśmiennictwa wynika, iż melatonina obok wielu funkcji obronnych przed działaniem RFT wpływa również na główny, enzymatyczny przeciwutleniacz, jakim jest dysmutaza ponadtlenkowa. Prace doświadczalne wykazują, że stymuluje ona aktywność CuZn-SOD oraz zwiększa liczbę cząsteczek mRNA kodującego ten enzym [19, 20, 21].

W badaniach własnych zaobserwowano wzrost aktywności tego enzymu po suplementacji melatoniną w grupie chorych z długoterminowym ograniczeniem aktywności ruchowej (wzrost o 23,3%).

Natomiast okres 10-dniowego podawania melatoniny pacjentom poddanym zabiegowi wymiany stawu biodrowego nie wpłynął tak stymulująco na aktywność CuZn-SOD (wzrost o 3,1%). W badaniu wzięły udział osoby w wieku około 72 lat, kiedy stężenie melatoniny ulega zmniejszeniu zarówno na poziomie tkankowym, jak i komórkowym. Należy przypuszczać, że osoby w tym wieku są narażone na większe uszkodzenia oksydacyjne i 10-dniowy okres suplementacji melatoniny był za krótki, aby można było wyrównać jej względny niedobór antyoksydacyjny. Poza tym, interpretując otrzymane wyniki badań w tej grupie badawczej, oprócz wpływu stresu pourazowego, krótkotrwałej hipokinezji, jakiej poddany jest chory po zabiegu, wieku chorego, należy także uwzględnić proces zapalny. Jak donoszą dane literaturowe, wyniki badań sugerują, że procesy indukujące degradacje chrząstki stawowej są zmianami o podłożu zapalnym [22, 23, 24, 25, 26].

W badaniach na zwierzętach wykazywano również działanie przeciwzapalne melatoniny. Hormon ten ograniczał proces zapalny poprzez hamowanie transkrypcji genów dla wielu cytokin prozapalnych oraz TNF-a  (czynnik-a  martwicy nowotworów) [27]. 

Uzyskane wyniki wyraźnie wskazują, że podawanie doustne melatoniny (5 mg) znacząco stymuluje aktywność głównego enzymu przeciwutleniającego, jakim jest dysmutaza ponadtlenkowa i tym samym wspomaga system obronny organizmu przeciw uszkodzeniom wywołanym przez RFT. Jednak rola antyoksydacyjna melatoniny wyraźniej widoczna jest dopiero po dłuższym okresie jej zastosowania.

WNIOSKI

Krótko- jak i długoterminowa hipokinezja prowadzi do generacji RFT, o czym świadczy wzrost aktywności CuZn-SOD w krwinkach czerwonych badanych grup. Melatonina podawana doustnie przez okres 30 dni znacznie zwiększa aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (+23,3%), w porównaniu do zastosowanego 10-dniowego okresu jej suplementacji (+3,1%). Stwierdzone korzystniejsze zmiany w grupie chorych poddanych długoterminowej hipokinezji mogą przemawiać za tym, że podawanie melatoniny lub czynników indukujących jej sekrecję, może być wykorzystywane jako terapia wspomagająca w leczeniu i rehabilitacji pacjentów z hipokinezją długoterminową.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Miller E., Rutkowski M., Mrowicka M., Matuszewski T.: Udział reaktywnych form tlenu w uszkodzeniu mięśni wywołanych hipokinezją. Pol Merk Lek 2007; 130: 314-317.

2.    Allegra M., Reiter R. J., Tan D.-X., Gentile C., Tesoriere L., Livrea M.A.: The chemistry of melatonin’s interaction with reactive species. J Pineal Res 2003; 34: 1-10.

3.    Hardeland R., Pandi-Perumal S.R., Cardinali D.P.: Melatonin. Int J Biochem Cell Biol 2006; 38: 313-316.

4.    Davydov V.V., Shvets V.N.: Lipid peroxidation in the heart of adult and old rats during immobilization stress. Exp Gerontol 2001; 36: 1155-1160.

5.    Kędziora J.: Free radical processes in conditioning and deconditioning. [W:] Greenleaf J.E. (ed.): Deconditioning and reconditioning. CRC Press, 2004: 61-78.

6.    Kondo H., Miura M., Nakagaki I., Sasaki S, Itokawa Y.: Trace element movement and oxidative stress In skeletal muscle atrophied by immobilization. Am J Physiol Endocrinol Metab 1992; 262: 583-590.

7.    Rodriguez C., Mayo J.C., Sainz R.M., Antolin I., Herrera F., Martin V., Reiter R.J.: Regulation of antioxidant enzymes: a significant role for melatonin. J Pineal Res 2004; 36: 1-9.

8.    Urata Y., Honma S., Goto S., Todoroki S., Iida T., Cho S., Honma K., Kondo T.: Melatonin induces γ-glutamylocysteine synthetase mediated by activator protein-1 in human vascular endothelial cells. Free Rad Biol Med 1999; 27: 838-847.

9.    Acuna-Castroviejo D., Martin M., Macias M., Escames G., Leon J., Khaldy H., Reiter R.J.: Melatonin, mitochondria and cellular bioenergetics. J Pineal Res 2001; 30: 65-74.

10.    Leon J., Acuna-Castroviejo D., Sainz R.M., Mayo J.C., Tan D-X., Reiter R.J.: Melatonin and mitochondrial function. Life Sci 2004; 75: 765-790.

11.    Misra H.P., Fridovich J.: The role of superoxide anion in the autooxidation of epinephrine and a simple assay for the superoxide dismutases. J Biol Chem 1972; 247: 3170-3175.

12.    Mrowicka M., Gałecka E., Miller E., Garncarek P.: Wpływ zmian zwyrodnieniowych na generację wolnych rodników tlenowych i peroksydację lipidów u chorych po przebytej alloplastyce stawu biodrowego. Pol Merk Lek 2008; 25: 145-149.

13.    Mrowicka M., Garncarek P., Bortnik K., Gałecka E., Miller E., Śmigielski J.: Aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (CuZn-SOD) w krwinkach czerwonych u pacjentów po alloplastyce stawu biodrowego. Pol Merk Lek 2008; 24: 143, 396-398.

14.    Mrowicka M., Garncarek P., Gałecka E., Miller E., Bortnik K., Żołyński K.: Aktywność katalazy i peroksydazy glutationowej w krwinkach czerwonych u pacjentów po endoprotezoplastyce stawu biodrowego. Kwart Ortop 2008; 2: 227-234.

15.    Zorbas Y.G., Yaroshenko Y.Y., Andreyev V.G., Kuznetsov N.K.: Bone tissue changes in rats during prolonged restriction of motor activity. Physiol Chem Phys Med 1998; 30: 219-228.

16.    Ostrowska Z., Wołkowska-Pokrywa K., Kos-Kudła B., Świętochowska E., Marek B., Kajdaniuk D.: Melatonina a stan kośca. Pol Merk Lek 2006; 21: 389-393.

17.    Kos-Kudła B., Marek B., Kajdaniuk D., Wołowska K., Ostrowska Z.: Perspektywy stosowania melatoniny w profilaktyce i leczeniu osteoporozy. Przegląd Menop 2003; 5: 43-46.

18.    Reiter R.J., Tan D.-X., Gitto E., Sainz R.M., Mayo J.C., Leon J., Manchester L.C., Vijayalaxmi, Kilic E., Kilic U.: Pharmacological utility of melatonin in reducing oxidative cellular and molecular damage. Pol J Pharmacol 2004; 56, 2: 159-170.

19.    Reiter R.J., Tan D.-X., Mayo J.C., Sainz R.M., Leon J., Czarnocki Z.: Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans. Acta Bioch Pol 2003; 50: 1129-1146.

20.    Antunes F., Barclay L.R.C., Ingold K.U., King M., Norris J.Q., Scaiano J.C., Xi F.: On the antioxidant activity of melatonin. Free Rad Biol Med 1999; 26: 117-128.

21.    Liu F., Ng T.B.: Effect of pineal indoles on activities of the antioxidant defense enzymes superoxide dismutase, catalase, and glutathione reductase, and levels of reduced and oxidized glutathione in rat tissues. Biochem Cell Biol 2000; 78: 447-453.

22.    Saito I., Koshino T., Nakashima K., Uesugi M., Saito T.: Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic. Osteoarthritis Cart 2002; 10: 156-162.

23.    Vuolteenaho K., Moilanen T., Hamalainen M., Moilanen E.: Regulation of nitric oxide production in osteoarthritic and rheumatoid cartilage. Scand J Rheumatol 2003; 32: 19-24.

24.    Malemud C.J., Islam N., Haqqi T.M.: Pathophysiological mechanisms in osteoarthritis lead to novel therapeutic strategies. Cells Tissues Organs 2003; 174: 34-48.

25.    Massicotte F., Lajeunesse D., Benderdour M., Pelletier J.P., Hilal G., Duval N., Martel-Pelletier J.: Can altered production of interleukin-1b, interleukin-6, transforming growth factor-b and prostaglandin E2 by isolated human subchondral osteoblasts identify two subgroups of osteoarthritic patients? Osteoarthritis Cart 2002; 10: 491-500.

26.    Honorati M.C., Bovara M., Cattini L., Piacentini A., Facchini A.: Contribution of interleukin 17 to human cartilage degradation and synovial inflammation in osteoarthritis. Osteoarthritis Cart 2002; 10: 799-807.

27.    Reiter R.J.: Melatonin and its relation to the immune system and inflammation. Ann N Y Acad Sci 2000; 917: 376-386.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Małgorzata Mrowicka
Katedra Biomedycznych Podstaw Fizjoterapii
Zakład Chemii i Biochemii Klinicznej UM
90-647 Łódź, ul. Pl. Hallera 1
e-mail: malgorzata.mrowicka@umed.lodz.pl

Pracę nadesłano: 25.03.2009 r.
Przyjęto do druku: 29.10.2009 r.