WSTĘP

Choroby układu krążenia są odpowiedzialne za około 50% wszystkich zgonów w Polsce, a prowadzone obserwacje dowodzą, że liczba ta wciąż rośnie. Jedną z najpoważniejszych postaci tych schorzeń jest zawał serca, który stwierdza się rocznie u około 100 000 mieszkańców Polski.

W ostatnich latach szczególne zainteresowanie budzą zmiany w układzie krążenia i związana z nimi apoptoza komórek mięśni gładkich obecnych w ścianach naczyń VSMC (Vascular Smooth Muscle Cells) [1, 2]. W prawidłowych tętnicach indeks apoptotyczny i mitotyczny jest mały, zmienia się natomiast w stanach patologicznych, a zaburzenia równowagi między proliferacją i apoptozą mogą sprzyjać progresji zmian chorobowych [3]. Ponadto, istnieje coraz więcej danych na temat ostrego niedokrwienia mięśnia sercowego, w trakcie którego może dochodzić zarówno do nekrotycznej, jak i apoptotycznej śmierci komórki [4]. W badaniach sekcyjnych u osób z zawałem serca apoptotyczne kardiomiocyty stwierdzono głównie w obrębie granicznej strefy hipoperfuzji wokół ogniska martwicy [5].

Apoptoza komórek może być indukowana za pośrednictwem sygnałów białkowych – ,,sygnałów śmierci’’, pochodzących od innych komórek, lub w wyniku reakcji na działanie czynników stresu takich jak: niedotlenowanie komórek, uszkodzenia DNA, aktywacja onkogenów [6, 7]. Różne rodzaje sygnałów aktywują enzymy proteolityczne zwane kaspazami [8, 9]. ,,Białkowe sygnały śmierci’’ są odbierane przez komórki za pośrednictwem swoistych receptorów. Najlepiej poznane receptory ,,sygnałów śmierci’’ należą do nadrodziny czynnika martwicy nowotworu TNF (Tumor Necrosis Factor) [10]. Do tej grupy zalicza się receptor Fas (CD95/Apo-1), który należy do receptorów glikozylowanych o masie 45 kDa i wiążąc swoisty ligand FasL, aktywuje kolejno kaspazy 8, 3, 6, 7, doprowadzając komórkę do śmierci na drodze apoptozy [11, 12, 13].

Ekspresję receptora Fas w komórkach prawidłowych stwierdzono na limfocytach T i B oraz na większości tkanek i narządów, między innymi: jelita, śledziony, serca, nerek i jajników [14]. Ligand FasL występuje na limfocytach T oraz komórkach NK (Natural Killer) [15]. Zarówno receptor, jak i ligand mogą być uwalniane do płynów ustrojowych, gdzie występują jako formy rozpuszczalne oznaczane w płynach biologicznych [16, 17, 18]. Celem pracy była ocena stężenia rozpuszczalnego receptora Fas (sFas) w surowicy osób z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST.

MATERIAŁ I METODY

Grupę badaną stanowiło 70 pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST w wieku od 42 do 75 lat (średnia wieku 58,3±7,6 lat). Wśród chorych było 40 mężczyzn w wieku od 53 do 66 lat (średnia wieku 56,3±4,0 lat) oraz 30 kobiet w wieku od 42 do 75 lat (średnia wieku 57,9±10,3 lat). U pacjentów rozpoznano pierwszy w życiu zawał mięśnia sercowego na podstawie objawów klinicznych, nieprawidłowości w zapisie elektrokardiograficznym (EKG), zwiększonych wartości markerów martwicy mięśnia sercowego i zaburzeń kurczliwości w badaniach obrazowych. Krew od każdego pacjenta pobierano w czterech okresach: I. w dniu przyjęcia, II. po 12 godzinach, III. po 24 godzinach, IV. w 5 dobie.

Materiałem wykorzystanym do badań była surowica krwi. Od każdego pacjenta pobierano 5 ml krwi z żyły łokciowej na skrzep. Po oddzieleniu powstałego skrzepu, krew wirowano z szybkością 2000 x g przez 10-15 minut. Tak otrzymaną surowicę zamrożono w temperaturze -22°C do czasu wykonania badań.

Do oznaczenia stężenia sFas zastosowano metodę immunoenzymatyczną ELISA. W tym celu wykorzystano zestaw Human sAPO-1/Fas ELISA firmy Bender MedSystems Diagnostics GmbH, Wiedeń, Austria. Czułość testu wynosiła 13,2 pg/ml. Wszystkie badane osoby wyraziły zgodę na przeprowadzenie badań. Uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach.

Wyniki poddano analizie statystycznej, korzystając z programu komputerowego Statistica for Windows wersja 8.0 oraz Microsoft Excel. W celu zweryfikowania rozkładu otrzymanych wyników zastosowano test Shapiro-Wilka. Po ustaleniu, że uzyskane wyniki odpowiadały rozkładowi normalnemu, dla każdego parametru obliczono średnią arytmetyczną (`c) i odchylenie standardowe (SD). Średnie wartości badanego parametru porównywano za pomocą testu t-Studenta. Za istotny statystycznie przyjmowano poziom p<0,05.

WYNIKI

W dniu przyjęcia stężenie sFas było największe i wahało się od 50,30 do 68,70 pg/ml (średnia 58,73±5,63 pg/ml). Po 12 godzinach stężenie badanego parametru wynosiło od 49,20 do 63,00 pg/ml (średnia 54,98±4,77 pg/ml) i było istotnie obniżone w porównaniu ze stężeniem stwierdzonym w dniu przyjęcia (p<0,001). Po 24 godzinach od przyjęcia stężenie sFas obejmowało zakres od 20,00 do 49,20 pg/ml (średnia 38,47±7,46 pg/ml) i bardzo istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczanym po 12 godzinach (p<0,0001). W 5 dobie stężenie receptora mieściło się w zakresie od 19,90 do 43,80 pg/ml (średnia 30,45±7,13 pg/ml) i istotnie malało w porównaniu ze stężeniem oznaczonym po 24 godzinach (p<0,001). Uzyskane wyniki zilustrowano na rycinie 1.

Przeprowadzono także analizę stężenia sFas w zależności od płci badanych pacjentów a uzyskane wyniki zilustrowano na rycinie 2. U kobiet stężenie sFas w dniu przyjęcia wahało się od 51,20 do 68,70 pg/ml (średnia 59,16±5,42 pg/ml) a po 12 godzinach mieściło się w zakresie od 49,20 do 42,40 pg/ml (średnia 54,66±4,81pg/ml). Po 24 godzinach stężenie badanego receptora obejmowało zakres od 20,00 do 42,12 pg/ml (średnia 34,06±6,32 pg/ml), natomiast w 5 dobie od 19,90 do 32,50 pg/ml (średnia 26,84±4,88 pg/ml). U badanych kobiet wartość parametru była najwyższa w dniu przyjęcia, natomiast w 5 dobie najniższa. Analiza statystyczna wykazała, że po 12 godzinach nastąpił niewielki nieistotny statystycznie spadek stężenia sFas. Analiza stężenia po 24 godzinach do stężenia po 12 godzinach wykazała istotny statystycznie spadek stężenia badanego receptora (p<0,001). Dalsza analiza wykazała, że stężenie badanego parametru w 5 dobie istotnie malało w porównaniu ze stężeniem po 24 godzinach (p<0,01).

U mężczyzn stężenie sFas w dniu przyjęcia wahało się od 50,30 do 67,60 pg/ml (średnia 58,29±6,09 pg/ml) a po 12 godzinach mieściło się w zakresie od 50,00 do 63,00 pg/ml (średnia 55,29±4,97 pg/ml). Po 24 godzinach stężenie badanego receptora obejmowało zakres od 29,50 do 49,20 pg/ml (średnia 42,88±5,86 pg/ml), natomiast w 5 dobie od 24,60 do 43,80 pg/ml (średnia 34,06±7,38 pg/ml). U wszystkich mężczyzn stężenie sFas było najwyższe w dniu przyjęcia, natomiast najniższe w 5 dobie. Analiza statystyczna wykazała, że po 12 godzinach nastąpił niewielki nieistotny statystycznie spadek stężenia sFas. Natomiast analiza stężenia po 24 godzinach do stężenia po 12 godzinach wykazała istotny statystycznie spadek stężenia badanego receptora (p<0,0001).

DYSKUSJA

Chorobom układu krążenia towarzyszą zaburzenia procesu apoptozy. Badania ostatnich lat wskazują na znaczenie zaprogramowanej śmierci komórek także w zawale mięśnia sercowego [19]. Wyjaśnienie molekularnych mechanizmów, które regulują apoptozę, może pomóc w opracowaniu nowych strategii rozpoznania i leczenia ostrych zespołów wieńcowych, w tym zawału serca [20, 21]. Uwagę zwracają badania nad możliwościami regulacji szlaków aktywacji programowanej śmierci komórki oraz nad czynnikami wpływającymi na te zjawiska. Najlepiej poznany jest układ receptora błonowego Fas i liganda FasL [22] oraz ich form rozpuszczalnych.

Z przeprowadzonych przez nas badań wynika, że u pacjentów z zawałem mięśnia sercowego z uniesieniem odcinka ST zaobserwowano wysokie stężenie rozpuszczalnego receptora Fas. Stężenie tego parametru zmieniało się w kolejnych dniach. Najwyższe było w dniu przyjęcia pacjenta i malało stopniowo w kolejnych okresach badania, zarówno po 12, jak i po 24 godzinach. Najmniejsze stężenie sFas obserwowano w 5 dobie, co wskazuje na znaczący udział procesu apoptozy w przebiegu zawału. Ponadto stwierdzono, że wartości te szybciej malały u kobiet niż u mężczyzn, co może wskazywać na udział także innych mechanizmów apoptozy u badanych kobiet.

Wzrost stężenia sFas w surowicy pacjentów z zawałem mięśnia sercowego stwierdzono także w badaniach przeprowadzonych przez Ohtsuka i wsp. [23]. Zdaniem tych autorów wzrost stężenia receptora był bezpośrednio uzależniony od ciężkości przypadku i niewydolności krążenia, natomiast nie zależał od rozległości zawału. Badania nad udziałem mechanizmów Fas-FasL u pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego prowadzili także Soeki i wsp. [24]. Wykazali, że u chorych dochodzi tylko do wzrostu stężenia sFas, natomiast nie zaobserwowali zmian stężenia jego liganda w porównaniu do grupy kontrolnej. Stężenie sFas w kolejnych dniach po zawale zmniejszało się aż do 14. dnia i utrzymywało się na podobnym poziomie do 21. dnia. Ponadto, w 1 dniu po zawale wyższe stężenie rozpuszczalnego receptora Fas obserwowano we krwi pobranej z zatok wieńcowych w porównaniu ze stężeniem we krwi obwodowej, co może sugerować, że sFas u tych chorych jest uwalniany w komórkach mięśnia sercowego.

Natomiast Shimizu i wsp. [25] badali rolę sFasL w patogenezie ostrego zawału mięśnia sercowego i u pacjentów z niestabilną dusznicą bolesną w porównaniu do grupy kontrolnej. Autorzy wykazali, że u chorych z zawałem stężenie badanego parametru szybko spadło w czasie 3 godzin, po czym następował szybki wzrost stężenia sFasL po przezskórnej angioplastyce. Z kolei Soeki i wsp. [24] nie zaobserwowali żadnych istotnych zmian stężenia rozpuszczalnego liganda dla receptora Fas u chorych z zawałem w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto, poziom sFasL nie zmieniał się w kolejnych dniach po zawale. Także Zhang i wsp. [26] oceniali stężenie sFas i sFasL w surowicy pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego. Zdaniem autorów oznaczanie stężenia sFas może służyć jako czuły marker oceniający odpowiedź organizmu na niedokrwienie.

Stężenie sFas oraz sFasL oceniano również u pacjentów z chorobą niedokrwienną, przed i po interwencji wieńcowej. Wykazano, że pacjenci w tydzień po implantacji stentów mieli znacząco wyższe stężenie sFasL i znacząco niższe sFas niż pacjenci bez interwencji wieńcowej. Stężenie sFasL u chorych, u których wykryto ponowne zwężenie wieńcowe było znacznie wyższe niż u pacjentów bez restenozy. Według badaczy pomiar sFas oraz sFasL jest przydatny w celu ustalenia wieńcowej restenozy [27].

Natomiast Hanasaki i wsp. [28] badali zaburzenia w układzie Fas-FasL u pacjentów z chorobami krążenia na poziomie molekularnym. Zdaniem autorów polimorfizm genu dla Fas może być uznany za czynnik ryzyka wystąpienia zawału mięśnia sercowego. Z kolei Bossowska i wsp. [29] zaobserwowali wzrost ekspresji cząsteczek Fas i FasL na powierzchni limfocytów krwi obwodowej u chorych z ostrym zawałem mięśnia sercowego i w grupie pacjentów z niestabilną dusznicą bolesną w porównaniu z grupą kontrolną. Ponadto, autorzy wykazali dodatnią korelację pomiędzy stężeniem frakcji LDL cholesterolu i nadciśnieniem tętniczym, a odsetkiem komórek CD95+ i CD95L+ w grupie pacjentów z zawałem. Zdaniem autorów zwiększona aktywacja białek Fas i FasL, do której dochodzi przed początkiem ostrego niedokrwienia, może mieć istotny wpływ na niestabilność blaszki miażdżycowej i wystąpienie ostrego zespołu wieńcowego. Pasqui i wsp. [30] sugerują, że nadmierna aktywacja limfocytów może przyczyniać się do nasilenia procesów proapoptotycznych, indukowanych poprzez zwiększoną ekspresję cząsteczek promujących śmierć komórki i zmniejszoną czynników wzrostu.

Obecnie prowadzone są także badania dotyczące znaczenia programowanej śmierci komórki w przypadku powikłań choroby wieńcowej. W unikalnym badaniu przyżyciowym SPECT wykrywano wczesne etapy śmierci apoptotycznej komórek u chorych z ostrym niedokrwieniem mięśnia sercowego, którym podano znakowaną technetem aneksynę V. W wyniku przeprowadzonego badania udokumentowano występowanie charakterystycznych dla apoptozy zmian w obrębie błon komórkowych u większości z badanych pacjentów [31]. W świetle innych badań dotyczących procesu remodelingu w układzie naczyniowym, apoptoza wydaje się spełniać rolę także w zmianach pozawałowych, takich jak gojenie blizny pozawałowej czy kardiomiopatia niedokrwienna [32, 33]. Udowodniono także wzrost częstości występowania komórek apoptotycznych w obrębie kardiomiocytów mięśnia sercowego w przebiegu zespołu reperfuzji [34]. Ponadto, trwają badania nad zastosowaniem czynników regulujących proces apoptozy w leczeniu zawału. Uważa się, że zahamowanie procesów apoptozy w mięśniu sercowym podczas zawału może być nowym celem terapeutycznym ograniczającym rozmiar zmian i dysfunkcji mięśnia sercowego. Dodatkowo, zablokowanie procesów apoptozy na drodze Fas-FasL może stanowić jedną z możliwych strategii w leczeniu stanów pozawałowych [35, 36]. W modelach doświadczalnych stosuje się między innymi terapię genową z wykorzystaniem sFasL i G-CSF, których działanie może prowadzić do złagodzenia objawów spowodowanych przebudową i dysfunkcją serca [37].

WNIOSKI

W wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że:

1. U pacjentów z zawałem serca obserwuje się nasilenie procesu apoptozy, co manifestuje się wzrostem stężenia rozpuszczalnego receptora Fas.

2. Pomiar stężenia sFas może okazać się pomocny w monitorowaniu przebiegu zawału mięśnia sercowego, co wymaga dalszych badań.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.    Lee Y., Gustafsson A.B.: Role of apoptosis in cardiovascular disease. Apoptosis 2009; 14 (4): 536-548.

2.    Korshunov V.A., Berc B.C.: Smooth muscle apoptosis and vascular remodeling. Curr Opin Hematol 2008; 15 (3): 250-254.

3.    McCarthy N.J., Bennett M.R.: The regulation of vascular smooth muscle cell apoptosis. Cardiovasc Res 2000; 45 (3): 747-755.

4.    McCully J.D., Wakiyama H., Hsieh Y.J., Jones M., Levitsky S.: Differential contribution of necrosis and apoptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 286 (5): H1923-1935.

5.    Urbanek T., Skop B., Wilczok T., Mazurek U., Wiaderkiewicz R.: Apoptoza w schorzeniach układu naczyniowego – implikacje kliniczne, przegląd piśmiennictwa. Chirurgia Polska 2003; 5 (1): 47-58.

6.    Wang A., Dean D.: Apoptosis, cell signaling, and human diseases: molecular mechanisms. IAMA 2007; 298: 2203-2204.

7.    Kam P.C., Ferch N.J.: Apoptosis: mechanisms and clinical implications. Anaesthesia 2000; 55: 1081-1093.

8.    Li J., Yuan J.: Caspases in apoptosis and beyond. Oncogene 2008; 27 (48): 6194-6206.

9.    Zidar N., Jera J., Maja J., Dusan S.: Caspases in myocardial infarction. Adv Clin Chem 2007; 44: 1-33.

10.    Zhang G.: Tumor necrosis factor family ligand-receptor binding. Curr Opin Struct Biol 2004; 14: 154-160.

11.    Strasser A., Jost P.J., Nagata S.: The many roles of FAS receptor signaling in the immune system. Immunity 2009; 30 (2): 180-192.

12.    Lettau M., Paulsen M., Kabelitz D., Janssen O.: Storage, expression and function of Fas ligand, the key death factor of immune cells. Curr Med Chem 2008; 15 (17): 1684-1696.

13.    Adam-Klages S., Adam D., Janssen O., Kabelitz D.: Death receptors and caspases: role in lymphocyte proliferation, cell death, and autoimmunity. Immunol Res 2005; 33 (2): 149-166.

14.    Brunner T., Wasem C., Torgler R., Cima I., Jakob S., Corazza N.: Fas (CD95/Apo-1) ligand regulation in T cell homeostasis, cell-mediated cytotoxicity and immune pathology. Semin Immunol 2003; 15 (3): 167-176.

15.    Screpanti V., Wallin R.P., Grandien A., Ljunggren H.G: Impact of FASL-induced apoptosis in the elimination of tumor cells by NK cells. Mol Immunol 2005; 42 (4): 495-499.

16.    Zaki Mel S., Auf F.A., Ghawalby N.A., Saddal N.M.: Clinical significance of serum soluble Fas, Fas ligand and fas in intrahepatic lymphocytes in chronic hepatitis C. Immunol Invest 2008; 37 (2): 163-170.

17.    Kondera-Anasz Z., Mielczarek-Palacz A., Sikora J.: Soluble Fas receptor and soluble Fas ligand in the serum of women with uterine tumors. Apoptosis 2005; 10 (5): 1143-1149.

18.    Onalan G., Selam B., Onalan R., Ceyhan T., Cincik M., Pabuccu R.: Serum and follicular fluid levels of soluble Fas and soluble Fas ligand in IVF cycles. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2006; 125 (1): 85-91.

19.    Abbate A., Bussani R., Amin M.S., Vetrovec G.W., Baldi A.: Acute myocardial infarction and heart failure: role of apoptosis. Int J Biochem Cell Biol 2006; 38 (11): 1834-1840.

20.    Morissette M.R., Rosenzweig A.: Targeting survival signaling in heart failure. Curr Opin Pharmacol 2005; 5 (2): 165-170.

21.    Polewczyk A., Janion M., Gasior M., Gierlotka M.: Myocardial infarction in the elderly. Clinical and therapeutic differences. Kardiol Pol 2008; 66 (2): 166-172.

22.    Feng Q.Z., Zhao Y.S., Abdelwahid E.: The role of Fas in the progression of ischemic heart failure: prohypertrophy or proapoptosis. Coron Artery Dis 2008; 19 (7): 527-534.

23.    Ohtsuka T., Hamada M., Sasaki O. i wsp.: Clinical implications of circulating soluble Fas and Fas ligand in patients with acute myocardial infarction. Coron Artery Dis 1999; 10 (4): 221-225.

24.    Soeki T., Tamura Y., Shinohara H., Sakabe K., Onose Y., Fukuda N.: Relation between circulating soluble Fas ligand and subsequent ventricular remodeling following myocardial infarction. Heart 2003; 89 (3): 339-341.

25.    Shimizu M., Fukuo K., Nagata S. i wsp.: Increased plasma levels of the soluble form of Fas ligand in patients with acute myocardial infarction and unstable angina pectoris. J Am Coll Cardiol 2002; 39 (4): 585-590.

26.    Zhang L., Zhang L., Li Y.H. i wsp.: High-dose glucose-insulin-potassium treatment reduces myocardial apoptosis in patients with acute myocardial infarction. Eur J Clin Invest 2005; 35 (3): 164-170.

27.    Hara H., Sato R., Katagiri T., Hasegawa M.: Evaluation of restenosis by serum levels of soluble Fas, Fas ligand and nuclear matrix protein before and after coronary intervention. J Cardiol 2000; 35 (2): 89-93.

28.    Hanasaki H., Takemura Y., Fukuo K. i wsp.: Fas promoter region gene polymorphism is associated with an increased risk for myocardial infarction. Hypertens Res 2009; 32 (4): 261-264.

29.    Bossowska A., Bossowski A., Galar B.: Analysis of apoptotic markers Fas/FasL (CD95/CD95L) expression on the lymphocytes in patients with acute coronary syndrome. Kardiol Pol 2007; 65 (8): 883-889.

30.    Pasqui A.L., Di Renzo M., Bova G. i wsp.: T cell activation and enhanced apoptosis in non-ST elevation myocardial infarction. Clin Exp Med 2003; 3 (1): 37-44.

31.    Hofstra L., Liem I.H., Dumont E.A. i wsp.: Visualisation of cell death in vivo in patients with acute myocardial infarction. Lancet 2000; 356 (9225): 209-212.

32.    Dorn G.W. 2nd.: Apoptotic and non-apoptotic programmed cardiomyocyte death in ventricular remodelling. Cardiovasc Res 2009; 81 (3): 465-473.

33.    Chandrashekhar Y.: Role of apoptosis in ventricular remodeling. Curr Heart Fail Rep 2005; 2 (1): 18-22.

34.    Holleyman C.R., Larson D.F.: Apoptosis in the ischemic reperfused myocardium. Perfusion 2001; 16 (6): 491-502.

35.    Li Y., Takemura G., Kosai K. i wsp.: Critical roles for the Fas/Fas ligand system in postinfarction ventricular remodeling and heart failure. Circ Res 2004; 95 (6): 627-636.

36.    Webster K.A.: Programmed death as a therapeutic target to reduce myocardial infarction. Trends Pharmacol Sci 2007; 28 (9): 492-499.

37.    Okada H., Takemura G., Kosai K. i wsp.: Combined therapy with cardioprotective cytokine administration and antiapoptotic gene transfer in postinfarction heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2009; 296 (3): H616-626.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji:

Aleksandra Mielczarek-Palacz
Katedra i Zakład Immunologii
i Serologii SUM
40-074 Katowice, ul. Raciborska 15
tel./fax: 32 208 74 12
e-mail: apalacz@sum.edu.pl

Pracę nadesłano: 14.09.2009 r.
Przyjęto do druku: 19.12.2009 r.