Badania były wykonane i finansowane w ramach projektu pracy własnej AM w Warszawie nr 1WK/W2/ 2004-2006 i 1WK/N/2004-2006

WSTĘP

Rozwój zapalenia trzustki jest procesem złożonym, którego przyczyny i mechanizm powstawania nie jest do końca poznany. W ostatnich latach coraz częściej przyczyn powstawania i rozwoju ostrego oraz przewlekłego zapalenia trzustki upatruje się w bezpośrednim destrukcyjnym działaniu na trzustkę reaktywnych form tlenu (RFT). Trwają intensywne badania nad dokładniejszym poznaniem roli RFT i antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych w patogenezie tych chorób [1, 2, 3],

Ostre zapalenie trzustki (OZT) jest związane z procesem zapalnym tego narządu i tkanek otaczających. Może przebiegać jako jednorazowy epizod lub powtarzające się nawroty, które prowadzą do włók-nienia i upośledzenia funkcji egzo- i endokrynnych oraz rozwoju przewlekłego zapalenia trzustki (PZT).

Główną przyczyną OZT są choroby dróg żółciowych, np. kamica żółciowa (30-60%) oraz alkohol, który odpowiada za ok. 30% wszystkich przypadków zachorowań. W etiopatogenezie OZT uszkodzenie komórek pęcherzykowych, poza przedwczesną aktywacją proenzymów trzustkowych, wiąże się ze stanem zapalnym. Aktywacja neutrofili, monocytów, makrofagów i komórek śródbłonka prowadzi do uwolnienia z nich mediatorów procesu zapalnego (cytokin), cząsteczek przylegania (np. selektyn, integryn), enzymów lizosomalnych oraz powstawania RFT, które w nadmiarze mogą stanowić czynniki odpowiedzialne za przejście miejscowego zapalenia w trzustce do rozwoju zespołu uogólnionej odpowiedzi zapalnej [4, 5].

Mechanizm indukcji PZT nie jest jasny. Wiele danych wskazuje, że na początku choroby przebiega jak OZT i wiąże się nadmiernym uwalnianiem mediatorów procesów zapalnych, wytwarzaniem dużych ilości RFT i niedostateczną aktywnością antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych, co prowadzi do postępującego uszkodzenia miąższu tego narządu, włóknienia i zaniku tkanki gruczołowej i upośledzenia funkcji wydzielniczych [6, 7].

Najczęstszym czynnikiem etiologicznym PZT u dorosłych jest długotrwałe spożywanie alkoholu. Szacuje się, że jest przyczyną 45-75% przypadków choroby. Trzustka ze względu na niską aktywność dehydrogenazy alkoholowej jest szczególnie narażona na toksyczne działanie etanolu i jego metabolitów. Mechanizm toksycznego działania etanolu na trzustkę wiąże się również z działaniem cytochromu P4502E1 i wytwarzaniem RFT podczas jego detoksykacji.

Innymi przyczynami PZT są nawracające ostre zapalenia trzustki, kamica żółciowa, wady rozwojowe i inne. Przewlekłe zmiany zapalne w trzustce bardzo często prowadzą do rozwoju raka [7, 8]. Ponieważ w patogenezie ostrego i przewlekłego zapalenia trzustki jednym z wielu proponowanych czynników jest stres oksydacyjny, celem podjętych badań była ocena antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych, ze szczególnym uwzględnieniem roli zredukowanego glutationu i enzymów GSH-zależnych. Określenie ich udziału i roli pozwoli na lepsze zrozumienie patofizjologicznych procesów prowadzących do rozwoju tych schorzeń.

MATERIAŁ I METODY

Badaniami objęto grupę 35 chorych z zapaleniem trzustki leczonych w Klinice Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej Akademii Medycznej w Warszawie w okresie od 2005 do 2007 roku. Grupa ta obejmowała 20 chorych z objawami łagodnej (obrzękowej) postaci ostrego zapalenia trzustki (12 mężczyzn i 8 kobiet w wieku 26-69 lat, śr. 46±10,5 lat) i 15 chorych z przewlekłym zapaleniem trzustki (9 mężczyzn i 6 kobiet w wieku 32-68 lat, śr. 47±9,1 lat) o krótkim czasie trwania choroby (< 36 miesięcy).

U większości badanych przyczyną OZT było nadużywanie alkoholu (16 chorych) i kamica pęcherzyka żółciowego - KPŻ (4 chorych). U chorych z PZT przyczyną choroby było nadużywanie alkoholu (9 chorych) oraz KPfl (5 chorych).

Rozpoznanie OZT i PZT postawiono na podstawie objawów klinicznych, wyników badań biochemicznych i obrazowych. Kryterium włączającym do badania stanowiło stwierdzenie u chorych OZT, którego objawy (bóle brzucha, nudności, wymioty) utrzymywały się nie dłużej niż 48 godzin. Kryterium przynależności do łagodnej postaci OZT oceniano w skali Ransona oraz według systemu APACH II (Acute Physiology and Chronić Health Evaluation) w ciągu pierwszych 24-48 godzin od przyjęcia każdego chorego do szpitala. W przypadku chorych z PZT zebrano dokładny wywiad dotyczący dolegliwości podmiotowych chorego, czasu ich trwania oraz stosowanych leków.

Krew do badań pobierano od chorych z OZT i PZT bezpośrednio po przyjęciu do szpitala (doba 0), przed rozpoczęciem leczenia zachowawczego. Grupę kontrolną stanowiła krew pobrana w Stacji Krwiodawstwa od 53 zdrowych osób: 32 kobiet i 21 mężczyzn (średnia wieku 42±11,2 lat). Otrzymaną surowicę przechowywano w temp. -20°C do momentu oznaczania.

U wszystkich chorych z OZT i PZT zakwalifikowanych do badań oznaczano w surowicy krwi markery stresu oksydacyjnego: stężenie związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), które określa poziom peroksydacji lipidów, stężenie zredukowanego glutationu (GSH) oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych: całkowitej peroksydazyglu-tationowej (cał. GSHPx), selenozależnej peroksy-dazy glutationowej (SeGSHPx), S-transferazy gluta-tionowej (GST) i reduktazy glutationowej (GSHR).

Poziom peroksydacji lipidów oznaczano wg metody Ohkawa i wsp. [9]. Metoda polega na oznaczeniu stężenia substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) - dialdehydu malonowe-go (MDA) i innych końcowych produktów peroksydacji lipidów.

Stężenie GSH oznaczano na podstawie metody opracowanej przez Sedlak i Lindsey [10]. Metoda ta oparta jest na tworzeniu barwnego produktu, który powstaje w reakcji GSH z kwasem 5,5'-ditio-bis-nitrobenzenowym (DTNB).

Aktywność cał. GSHPx (EC 1.11.1.9) oznaczano wg metody Wendel [11]. W metodzie tej GSHPx katalizuje utlenianie GSH przy udziale nadtlenku kumenu. Jedna jednostka aktywności peroksydazy katalizuje utlenienie przez nadtlenek kumenu 1 mmol GSH w czasie 1 minuty przy pH 7,0 i w temperaturze 37°C.

Aktywność Se-GSHPx (EC 1.11.1.9) oznaczano na podstawie metody opisanej przez Wendel [11] oraz Paglia i Valentine [12]. W metodzie tej Se-GSHPx katalizuje utlenianie GSH przy udziale nadtlenku wodoru. Za jednostkę aktywności Se-GSHPx przyjęto taką ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 mmola zredukowanego GSH do jego formy utlenionej (GSSG) w czasie 1 minuty przy pH 7,0 i w temperaturze 37°C.

Aktywność GST (EC 2.5.1.18) oznaczano wg metody Habig i wsp. [13], stosując jako substrat 1-chloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB). Jedna jednostka aktywności GST odpowiadała takiej ilości enzymu, która katalizowała przekształcenie 1 mmola substra-tu w produkt w ciągu 1 minuty.

Aktywność GSHR (EC 1.6.4.2) oznaczano według metody opisanej przez Goldberg i Spooner [14]. Jako substratu użyto utlenionego glutationu (GSSG). Za jednostkę aktywności przyjęto taką ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1 mmola utlenionego glutationu (GSSG) do jego formy zredukowanej (GSH) w czasie 1 minuty i w temperaturze 37°C.

Pomiary absorbancji we wszystkich oznaczeniach wykonywano w spektrofotometrze Shimadzu UV 1202.

Aktywność badanych enzymów w surowicy wyrażono w U/l. Stężenie GSH i TBARS wyrażono odpowiednio w /j,mol/ml i nmol/ml surowicy.

Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej z wykorzystaniem programu Statistica 6.0 Stat-Stof. Inc. (St. Tulsa, USA). Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnie arytmetyczne z trzech powtórzeń ± SD.

Istotność różnic oznaczono testem t-Studenta. Różnice między średnimi arytmetycznymi przyjęto za istotne statystycznie przy p<0,05.

Badania były prowadzone za zgodą Komisji Bioetycznej Akademii Medycznej w Warszawie (decyzja KB 164/2001) i za zgodą pacjentów.

WYNIKI

Stężenie markerów stresu oksydacyjnego (TBARS i GSH) oraz aktywność enzymów GSH-zależnych (cał. GSHPx, Se-GSHPx, GST, GSHR) w surowicy krwi chorych z OZT i PZT przedstawiono graficznie na rycinach 1-3. Są one wyrażone jako średnie arytmetyczne ± odchylenie standardowe (SD).

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono istotne statystycznie podwyższenie poziomu peroksydacji lipidów mierzonego ilością TBARS w surowicy chorych z OZT i PZT (odpowiednio: 3,64±2,12 i 4,18±1,43 nmoli/ml) w porównaniu z surowicą kontrolną (l,54±0,56 nmoli/ml) (p<0,05) (ryc. 1). OZT i PZT doprowadzało również do zmian w stężeniu zredukowanego glutationu (GSH) w surowicy chorych. Stężenie GSH było niższe w surowicy chorych z OZT i PZT w porównaniu z surowicą kontrolną (27,72±9,93 /j,moli/ml) i wynosiło odpowiednio: 23,72±6,47 i 16,89±5,30 ^moli/ml (ryc. 2). Najniższe stężenie GSH stwierdzono w surowicy chorych z PZT. Zaobserwowane różnice były statystycznie istotne (p<0,05).

Stwierdzono istotny spadek aktywności cał.

GSHPx w surowicy chorych z OZT i PZT - odpowiednio: 66,87±19,80 i 55,05±21,88 U/l w porównaniu do surowicy kontrolnej (101,86±26,87 U/l) (p< 0,05). Natomiast aktywność Se-GSHPx w surowicy chorych z OZT (110,74±25,80 U/l) pozostawała na tym samym poziomie jak w surowicy kontrolnej (108,12±42,19 U/l), ale wyraźnie obniżała się w surowicach chorych z PZT (80,26±37,45 U/l), zarówno w porównaniu z surowicą kontrolną, jak i surowicą chorych z OZT (p<0,05) (ryc. 3A i B).

Wykazano podwyższenie aktywności GSHRw surowicy chorych z OZT i PZT, która wynosiła odpowiednio: 37,29±13,77 i 32,49±10,98U/l w porównaniu do aktywności w surowicy kontrolnej (29,55±ll,90 U/l) (ryc. 3C). Również aktywność GST w surowicy chorych z OZT i PZT była podwyższona (odpowiednio: 7,22±3,17 i 7,02±3,46 U/l) w stosunku do surowicy kontrolnej (5,7±2,31 U/l) (ryc. 3D).

DYSKUSJA

Uzyskane w pracy wyniki wskazują, że trzustka jest narażona na działanie RFT, a ich nadmiar może przyczyniać się do powstawania i rozwoju OZT i PZT.

W badaniach przeprowadzonych na modelach zwierzęcych wykazano, że akumulacja RFT w trzustce pełni kluczową rolę w patogenezie ostrego zapalenia tego narządu i że stres oksydacyjny występuje już we wczesnych stadiach tej choroby [2, 15, 16]. Znalazło to potwierdzenie również w naszych badaniach. Wysoki poziom peroksydacji lipidów w surowicy chorych z OZT i PZT wskazuje na nasilający się proces zapalny w trzustce. Uwalniane w ąwybuchu tlenowym" RFT inicjują peroksydację lipidów, czego następstwem jest utrata integralności błon komórkowych i wzrost ich przepuszczalności, co prowadzi w OZT do uszkodzenia miąższu trzustki, a w późniejszych stadiach choroby (PZT) - upośledzenia jej funkcji endokrynnej. Stwierdzony przez nas wysoki poziom peroksydacji lipidów w surowicy chorych z OZT i PZT świadczy nie tylko o stresie oksydacyjnym w trzustce, ale również o niewydolności antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych. Zaobserwowane zmiany są zgodne z wynikami badań Sajewicza i wsp. oraz Verlaan i wsp. [17, 18].

Obniżone stężenie GSH w surowicy chorych z OZT i PZT oraz zmiany aktywności enzymów GSH-zależnych wskazuje na ogólnoustrojowe osłabienie zdolności antyoksydacyjnych organizmu. GSH i enzymy GSH-zależne pełnią istotną rolę w ochronie komórek przed toksycznym działaniem RFT i powstawaniem w nich wolnorodnikowych uszkodzeń.
 
GSH jest nie tylko bardzo efektywnym zmiataczem RFT, ale też uczestniczy w reakcjach katalizowanych przez enzymy GSH-zależne, do których zaliczamy: peroksydazę (GSHPx), transferazę (GST) oraz re-duktazę glutationową (GSHR) [18, 19, 20].

Peroksydaza bierze udział w redukcji nadtlenku wodoru oraz nadtlenków lipidowych. Selenoza-leżna peroksydaza glutationową (Se-GSHPx) unie-czynnia przede wszystkim H2O2, natomiast całkowita GSH-Px (cał. GSHPx) - głównie nadtlenki organiczne, powstające w komórce w wyniku peroksydacji lipidów. Powstający w tych reakcjach disul-fid glutationu (GSSG) jest redukowany przez NADPH do jego formy zredukowanej (2GSH) w reakcji katalizowanej przez reduktazę glutationową (GSHR). S-transferaza glutationową (GST) neutralizuje reaktywne formy tlenu, produkty peroksydacji lipidów, a także endo- i egzogenne związki o działaniu mutagennym i kancerogennym [21, 22].

Obniżone stężenie GSH zwłaszcza w surowicy chorych z PZT może być wynikiem jego zużycia w enzymatycznych reakcjach unieczynniania generowanych w trzustce nadmiernych ilości RFT (szczególnie nadtlenku wodoru i nadtlenków lipidowych), na co wskazują zmiany w aktywności enzymów GSH-zależnych [18].

Nieznaczny wzrost aktywności GSHR w surowicy chorych z OZT i PZT w porównaniu z surowicą kontrolną przy nasilonym stresie oksydacyjnym wskazuje tylko na ograniczoną możliwość przekształcenia utlenionej formy glutationu GSSG do GSH.

Zaobserwowane zmiany w poziomie peroksydacji lipidów, stężeniu GSH i aktywności enzymów GSH-zależnych w surowicy chorych z OZT i PZT świadczą z jednej strony o nasilonym stresie oksydacyjnym, a z drugiej o wyczerpywaniu się enzymatycznych mechanizmów antyoksydacyjnych w miarę jak nasila się powstawanie patologicznych zmian w trzustce. Brak równowagi pomiędzy wytwarzaniem RFT a obroną antyoksydacyjną w komórkach trzustki prowadzi nie tylko do osłabienia miejscowych, ale i ogólnoustrojowych mechanizmów antyoksydacyjnych.

WNIOSKI

Podwyższony poziom peroksydacji lipidów, obniżone stężenie GSH oraz zmiany w aktywności enzymów GSH-zależnych w surowicy chorych z OZT i PZT w porównaniu z surowicą kontrolną wskazują na udział RFT w patogenezie tych schorzeń oraz wyraźne ogólnoustrojowe upośledzenie antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych.

..............................................................................................................................................................
 
PIŚMIENNICTWO

1.    Schoenberg M.H., Birk D., Beger H.G.: Oxidative stress in acute and chronić pancreatitis. Am J Clin Nutr 1995; 62 (6): 1306S-14S.

2.    Rau B., Poch B., Gansauge E, Bauer A, Nussler AK, Nevalainen T., Schoenberg,  M.H.,  Beger H.G.: Pathophysiologic Role of Oxygen Free Radicals in Acute Pancreatitis: Initiating Event or Mediator of Tissue Damage? Annals of Surgery 2000; 231 (3): 352-360.

3.    Park B.K., Chung J.B., Lee J.H., Suh J.H., Park S.W., Song S.Y., Kom H., Kim K.H., Kang J.K.: Role of oxygen free radicals in patients with acute pancreatitis. Word J Gastroenterol 2003; 9 (100): 2266-2269.

4.    Wereszczyńska-Siemiątkowska U., Kamieński K: Rola cytokin i cząsteczek przylegania w ostrym zapaleniu trzustki. Gastroentorologia Polska 2000; 7 (5-6): 319-323.

5.    Gomez-Cambronero L.G., Sabater L, Pereda J., Cassinello N., Camps B., Vina J., Sastre J.: Role of cytokines and oxidative stress in the pathophysiology of acute pancreatitis: therapeutical implications. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 2002; 1 (4): 393-403.

6.    Braganza O.: The pathogenesisi of chronić panceratitis. Q.J.M. 1996; 89: 234-250.

7.    Stevens T., Conwell D.L., Zuccaro G.: Pathogenesis of chronić pancreatitis: an evidence-based review of past theories and recent developments. Am J Gastroenterol 2004; 99 (11): 2256-2270.

8.    Rydzewska G., Jedynak M.: Patogeneza przewlekłego alkoholowego zapalenia trzustki. Gastroenterologia Polska 1998; 5(1): 83-89.

9.    Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K: Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1968; 25: 192-205.

10.    Sedlak J., Lindsay R.H.: Estimation of total, protein-bound, and and nonprotein sulfhydryl groups in tissue with Ellman's reagent. Anal Biochem 1968; 25: 192-205.

11.    Wendel A.: Glutathione peroxidase. Methods Enzymol 1981; 77: 325-333.

12.    Paglia D., Valentine W.: Studies on the quantitative and qualitative characterization of erythrocytes glutathione peroxidase. J Lab Clin Med 1967; 70: 158-168.

13.    Habig W.H., Pabst M., Jacoby W.: Glutathione S-transferase, the first step in mercapturic acid formation. J Biol Chem 1974; 249: 7130-7139.

14.    Golberg D.M., Spooner R.J.: Methodes Enzymatic Analysis (Bregmayer HV, ed). Verlag Chemie 1987: 258-265.

15.    Schoenberg M.H., Buchler M., Beger H.G.: Oxygen radicals in experimental acute    pancreatitis. Hepatogastroenterology 1994; 41 (4): 313-319.

16.    Tsai K., Wang S.S., Chen T.S., Kong C.W., Chang F.Y., Lee S.D., Lu EJ.: Oxidative stress: an important phenomenon with pathogenic significance in the progression of acute panceratitis. Gut 1998: 850-855.

17.    Sajewicz W., Milnerowicz S., Nabzdyk S.: Blood plasma antioxidant defense in patients with   pancreatitis.Pancreas 2006; 32 (2): 139-144.

18.    Verlaan M., Roelofs H.M., van-Schaik A., Wanten G.J., Jansen J.B., Peters W.H., Drenth J.P: Assessment of oxidative stress in chronić pancreatitis patients. World J Gastroenterol 2006; 12 (35): 5705-5710.

19.    Hayes J.D., McLellan LI.: Glutathione and glutathione - dependent enzymes represent a coordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic Res 1999; 31: 273-300.

20.    Sies H.: Glutathione and its role in cellular functions. Free Rad Biol Med 1999; 27: 916-921.

21.    Michelson A.M.: Selenium glutathione peroxidase: some aspects in man. J Environ Pathol Toxicol Oncol 1998; 17: 233-239.

22.    Tew K.D., Ronai Z.: GST function in drug and stress response. Drug Resist Updat 1999; 2: 143-147.

..............................................................................................................................................................

Autorzy dziękują za pomoc techniczną Pani Elżbiecie Mętrak.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji

Hanna Czeczot
Katedra i Zakład Biochemii WUM
02-097 Warszawa,
ul. Banacha 1 tel.: 22 572 06 93
e-mail: hanna.czeczot@wp.pl

Pracę nadesłano: 22.04.2009 r.
Przyjęto do druku: 10.09.2009 r.