WSTĘP

Jedną z głównych przyczyn powstawania nowotworów, w tym także nowotworów przewodu pokarmowego, są zaburzenia w metabolizmie wolnych rodników tlenowych i ich reaktywnych pochodnych (RFT). RFT z powodu swojej reaktywności posiadają zdolność do niespecyficznego utleniania białek, kwasów nukleinowych i lipidów, co stanowi poważne zagrożenie dla integralności i prawidłowego funkcjonowania komórek. Szczególnie lipidy, będące składnikiem błon komórkowych, są podatne na wpływ RFT, zapoczątkowujący wolnorodnikowy proces ich peroksydacji. Prowadzi to do utleniania nienasyconych kwasów tłuszczowych, z jednoczesnym wytwarzaniem nadtlenków, które mogą reagować z błonowymi i cytoplazmatycznymi białkami lub ulegają dalszym przemianom do stabilnych, nierodnikowych związków o charakterze aldehydów i ich pochodnych, np. dialdehydu malonowego (MDA), 4-hydroksynonenalu (4-HNE), sprzężonych dienów i innych – określanych wspólnym mianem „substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym” (TBARS) [1, 2, 3].

Wytwarzany w procesie peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, wchodzących w skład fosfolipidów błonowych, MDA wykazuje dużą reaktywność względem białek i kwasów nukleinowych. Z miejsc, w których powstaje, łatwo przenika do odległych tkanek i tam, dzięki możliwości tworzenia wiązań kowalencyjnych z tymi związkami, może modyfikować ich strukturę i zmieniać ich właściwości [4, 5, 6].

MDA modyfikuje właściwości fizyczne błon komórkowych, powoduje zakłócenia hydrofobowości lipidowego wnętrza i naruszenie dwuwarstwowej struktury błon, co prowadzi do utraty ich integralności [4, 7].

Z danych piśmiennictwa wynika, że oznaczenie stężenia TBARS może być istotnym wskaźnikiem procesów peroksydacji lipidów zachodzących w organizmie, zwłaszcza w etiopatogenezie wielu schorzeń, w tym choroby nowotworowej [1, 7, 8, 9].

Przewód pokarmowy jest szczególnie narażony na stres oksydacyjny. Długotrwała ekspozycja przewodu pokarmowego na antygeny pokarmowe, bakteryjne czy wirusowe wiąże się z uwalnianiem mediatorów procesów zapalnych oraz nadmiernym wytwarzaniem wolnych rodników i ich pochodnych. Reakcje przebiegające w wyniku pobudzenia granulocytów i makrofagów są dodatkowym źródłem aktywnych metabolitów tlenowych, a stymulacja leukocytów prowadzi do „wybuchu tlenowego”. Stres oksydacyjny w przewodzie pokarmowym nasila się w wyniku kaskady zjawisk towarzyszących niedotlenieniu, niedokrwieniu, a następnie reperfuzji, co ma miejsce w stanach zapalnych przewodu pokarmowego, poprzedzających bardzo często powstawanie zamian nowotworowych [10, 11]. Etiopatogeneza nowotworów przewodu pokarmowego pozostaje nadal nieznana, jednak coraz częściej podnosi się udział stresu oksydacyjnego w ich powstawaniu [12].

Pomimo, że rośnie liczba danych dokumentujących rolę stresu oksydacyjnego w stanach zapalnych i zmianach nowotworowych przewodu pokarmowego, to wiedza ta jest niewystarczająca. Dlatego też, celem podjętych badań jest ocena poziomu peroksydacji jako wskaźnika  stresu oksydacyjnego w nowotworach przewodu pokarmowego.

MATERIAŁY I METODY

Odczynniki chemiczne

Odczynniki użyte w badaniach pochodziły z następujących źródeł: EDTA, kwas tiobarbiturowy (TBA) z firmy Sigma.

Pacjenci

Badaniami objęto grupę 170 osób w wieku od 26 do 90 lat, operowanych z powodu nowotworów przewodu pokarmowego. Przebadana grupa obejmowała: 10 chorych z rakiem gruczołowym żołądka, 20 z rakiem trzustki, 30 z nowotworami pierwotnymi wątroby, 60 z pierwotnym rakiem jelita grubego oraz 50 z metachronicznymi przerzutami raka jelita grubego do wątroby. Badaniom poddano również 30 chorych z marskością wątroby, którą potraktowano jako stan przedrakowy. Grupa ta obejmowała 12 kobiet i 18 mężczyzn (w przedziale wiekowym 23-52 lata). Łącznie przebadano 200 chorych. Średnia wieku pacjentów z nowotworami przewodu pokarmowego wynosiła 58,1±11,6 lat, natomiast w przypadku chorych z marskością wynosiła 33,3±8,9 lat.

Wszystkie przebadane typy nowotworów miały rozpoznanie chirurgiczne i histopatologiczne. U chorych z rakiem żołądka (adenocarcinoma) stwierdzono obecność Helicobacter pylori w błonie śluzowej żołądka. Nowotwory pierwotne wątroby przebadane w pracy należały do wątrobowokomórkowych (hepatocellular carcinoma), natomiast nowotwory trzustki i pierwotne nowotwory jelita grubego rozpoznano jako gruczolakoraki (adenocarcinoma). Przerzuty raka jelita grubego do wątroby miały charakter metachroniczny.

Badana w pracy grupa chorych nie była przed operacją poddawana chemio- i radioterapii. W grupie chorych z marskością wątroby jako przyczynę marskości stwierdzono infekcje HBV i HCV lub nadużywanie alkoholu.

Materiał badawczy

Materiał badawczy stanowiła krew pochodząca od chorych operowanych w latach 2002-2006 w Klinice Chirurgii Ogólnej, Transplantacyjnej i Wątroby, Klinice Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Żywienia oraz Klinice Chirurgii Ogólnej i Transplantacyjnej Akademii Medycznej w Warszawie.

Krew pobierano od chorych 1 dzień przed operacją i 6 dni po operacji (w miarę możliwości). Kontrolę stanowiła krew pobrana w Stacji Krwiodawstwa od 53 zdrowych dawców w przedziale 18-65 lat: 32 kobiet i 21 mężczyzn (średnia wieku 36±11,2 lat), nie leczonych z powodu choroby nowotworowej czy marskości wątroby. Surowice krwi do momentu wykonywania oznaczeń przechowywano w  -70°C.

Oznaczanie stężenia substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym – TBARS  

Stężenie substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS) – dialdehydu malonowego (MDA) i innych wtórnych produktów peroksydacji lipidów – oznaczano według metody Ohkawa i wsp. [13]. Ilość barwnego produktu, powstającego w reakcji produktów peroksydacji lipidów z kwasem tiobarbiturowym (TBA), mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 532 nm.

Analiza statystyczna

Wszystkie oznaczenia wykonano w dwóch powtórzeniach. Stężenie TBARS w surowicy wyrażono w nmol/l.

Otrzymane wyniki poddano analizie statystycznej z zastosowaniem programu STATISTICA 6.0. Obliczono średnie arytmetyczne (x) z odchyleniami standardowymi (SD). W ocenie istotności statystycznej różnic między średnimi przyjęto stopień istotności p≤0,05 i zastosowano odpowiednie testy statystyczne. W celu określenia rozkładu (oceny normalności) analizowanych zmiennych zastosowano test Shapiro-Wilka. W zależności od uzyskanego rozkładu dla porównania wartości zmiennych w dwóch grupach stosowano parametryczny test t lub nieparametryczny test Manna-Whitneya.

Badania prowadzone były za zgodą Komisji Bioetycznej przy Akademii Medycznej w Warszawie (decyzja KB/164/2001 dnia 09.10.2001 r.) i za zgodą pacjentów.

Badania były finansowane w ramach tematu pracy własnej nr 1WK/W2/04 i 1WK/W2/05 oraz projektu promotorskiego AM nr 1WK/WP2/06.

WYNIKI

Wyniki dotyczące określenia poziomu peroksydacji lipidów, oznaczonego jako stężenie związków reagujących z kwasem tiobarbiturowym (TBARS), w przed- i pooperacyjnej surowicy krwi chorych z nowotworami przewodu pokarmowego zostały wyrażone w pracy jako średnie arytmetyczne ± odchylenie standardowe (x ± SD).

Tabela I przedstawia analizę średnich wieku oraz liczebności w badanych grupach chorych z podziałem na płeć.

Badaniami objęto 170 chorych z nowotworami przewodu pokarmowego oraz 30 chorych z marskością wątroby, w tym 85 kobiet i 115 mężczyzn. W każdej z badanych grup stwierdzono niewielką przewagę liczebną mężczyzn, co jest zgodne z danymi literaturowymi, z których wiadomo, że nowotwory przewodu pokarmowego a także marskość wątroby występują częściej u mężczyzn niż u kobiet [14].

W celu stwierdzenia czy wiek badanych osób miał wpływ na stężenie TBARS (wskaźnika poziomu peroksydacji lipidów) przeprowadzono analizę jego stężenia w surowicy krwi osób z grupy kontrolnej w dwóch przedziałach wiekowych: wiek <40 (n=30; średni wiek: 26,5±5,2; przedział 18-38 lat) i wiek >40 lat (n=23; średni wiek: 56,1±9,6; przedział 40-65 lat) – tabela II.

Przeprowadzona analiza nie wykazała istotnych różnic w stężeniu TBARS w  surowicy krwi osób w przedziałach wiekowych <40 i >40 lat. W związku z tym, w pracy jako kontrolę zastosowano średnie stężenie TBARS w surowicy krwi otrzymane dla całej grupy kontrolnej.

Tabela III przedstawia średnie stężenie TBARS w przed- i pooperacyjnej surowicy krwi chorych z nowotworami przewodu pokarmowego oraz w surowicy zdrowych dawców krwi (surowica kontrolna).

W surowicy krwi pobranej od chorych z rakiem żołądka przed operacją stężenie TBARS było dużo większe niż w grupie kontrolnej, po operacji ulegało znacznemu obniżeniu, ale nadal było statystycznie istotnie podwyższone w porównaniu z kontrolą (p≤0,05). U chorych z pierwotnymi nowotworami wątroby zaobserwowano statystycznie istotne zwiększenie stężenia TBARS w surowicy krwi pobranej przed operacją w porównaniu z kontrolą. Po operacji stężenie TBARS było zbliżone do stężenia w surowicy kontrolnej, przy czym wykazano istotne jego obniżenie w stosunku do surowicy przedoperacyjnej (p≤0,05).

Stężenie TBARS w surowicy przed- i pooperacyjnej chorych z rakiem trzustki i pierwotnymi nowotworami jelita grubego było podobne i statystycznie istotnie podwyższone w porównaniu z surowicą kontrolną. W surowicy krwi chorych z przerzutami raka jelita grubego do wątroby przed operacją stężenie TBARS było istotnie podwyższone w stosunku do surowicy kontrolnej (p≤0,05), a po operacji uległo obniżeniu, ale było nieznacznie wyższe niż w kontroli.

Ponieważ w licznych badaniach stwierdzono, że u ponad 80% chorych z pierwotnym rakiem wątroby rozwija się on na podłożu marskiej wątroby, dlatego do badań została włączona również grupa chorych z marskością wątroby. Tabela IV przedstawia stężenie TBARS w surowicy przed- i pooperacyjnej chorych z marskością wątroby. Stwierdzono statystycznie istotny wzrost stężenia TBARS zarówno w surowicy przed-, jak i pooperacyjnej w porównaniu z surowicą kontrolną (p≤0,05).

Analiza profilu stężenia TBARS w przedoperacyjnej surowicy chorych z nowotworami przewodu pokarmowego oraz w surowicy kontrolnej wykazała najwyższy poziom TBARS u chorych z rakiem żołądka, natomiast najniższe ich stężenie wykazano u chorych z nowotworami pierwotnymi wątroby (tab. III).

Po operacji stężenie TBARS ulegało wyraźnemu obniżeniu w surowicy chorych ze  wszystkimi badanymi typami nowotworów przewodu pokarmowego, z wyjątkiem chorych z rakiem trzustki i pierwotnymi nowotworami jelita grubego.

Wszystkie badane surowice zarówno przed-, jak i pooperacyjne charakteryzował podwyższony w stosunku do surowicy kontrolnej poziom TBARS.

DYSKUSJA

Peroksydacja lipidów nieodłącznie towarzyszy działaniu RFT, a jej nasilenie wyrażone wzrostem stężenia TBARS jest markerem stresu oksydacyjnego.

Uzyskane w pracy wyniki wskazują, że proces peroksydacji lipidów, jaki ma miejsce w komórkach guzów przewodu pokarmowego oraz marskiej wątrobie, prowadzi do wzrostu stężenia jego końcowych produktów w surowicy krwi chorych. Potwierdzają to również inne badania naukowe, w których obserwowano wzrost stężenia TBARS, zarówno w stanach przedrakowych (np. marskość wątroby), jak i w tkankach zmienionych nowotworowo oraz w erytrocytach, osoczu czy surowicy krwi chorych z różnymi typami nowotworów [15, 16, 17].

Zbyt duże nasilenie procesu peroksydacji lipidów jest dla organizmu niekorzystne, ponieważ  końcowe produkty peroksydacji lipidów, szczególnie MDA, wykazują właściwości cytotoksyczne, mutagenne i prokancerogenne. Mogą one też powodować hamowanie enzymów, związanych z obroną komórek przed stresem oksydacyjnym, a tym samym prowadzić do zwiększania w nich ilości uszkodzeń oksydacyjnych. Nagromadzenie tych uszkodzeń może wywoływać takie zmiany w metabolizmie komórki, które są przyczyną utraty jej integralności i śmierci na drodze apoptozy lub nekrozy [5, 6, 18].

Poziom peroksydacji lipidów w surowicach pobieranych od chorych z nowotworami przewodu pokarmowego przed i po operacji świadczy o stresie oksydacyjnym, co może mieć wpływ na obwodowe mechanizmy antyoksydacyjne. Wykazana w pracy wyższa średnia wieku w grupie chorych z nowotworami przewodu pokarmowego (58,1 ± 11,6) niż w grupie kontrolnej oraz wiedza, że wraz z wiekiem dochodzi do zmniejszenia aktywności enzymów antyoksydacyjnych we krwi obwodowej, co nasila stres oksydacyjny [19, 20], mogłyby sugerować, że poziom peroksydacji lipidów wynika z wieku badanych pacjentów, a nie z choroby nowotworowej. Z tego powodu, porównano stężenia TBARS w surowicy krwi chorych oraz surowicy pochodzącej od zdrowych dawców w zależności od wieku (tab. II). Nie stwierdzono jednak istotnych różnic w stężeniu TBARS w surowicy osób z grupy kontrolnej w dwóch przedziałach wiekowych <40 i >40 lat, co wyklucza wpływ wieku na wyniki uzyskane w pracy dla chorych z nowotworami przewodu pokarmowego.

Wykazane w naszych badaniach podwyższone stężenie TBARS w surowicy krwi  chorych z nowotworami przewodu pokarmowego świadczy o nasileniu  stresu oksydacyjnego nie tylko lokalnie (w guzach), ale i w krwi obwodowej, co może sprzyjać zaburzeniu antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych organizmu. Potwierdzają to również inne badania  [21-25].

W świetle uzyskanych w pracy wyników wzrost stężenia TBARS w surowicy krwi przed- i pooperacyjnej w porównaniu do surowicy kontrolnej wydaje się być tego typu zmianą, która występuje zarówno w grupie chorych z marskością wątroby, jak i nowotworami przewodu pokarmowego. Potwierdza to przydatność oznaczania stężenia TBARS w surowicy krwi jako markera stresu oksydacyjnego szczególnie w schorzeniach z wolnorodnikową etiopatogenezą.

WNIOSKI

Wykazane w naszych badaniach podwyższone stężenie TBARS w surowicy krwi chorych z nowotworami przewodu pokarmowego świadczy o nasileniu  stresu oksydacyjnego nie tylko lokalnie (w guzach), ale i we krwi obwodowej, co może sprzyjać zaburzeniu antyoksydacyjnych mechanizmów obronnych organizmu.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.     Klauning J.E., Kamendulis L.M.: The role of oxidative stress in carcinogenesis. Annu Rev Pharmacol Toxicol 2004; 44: 239-267.

2.     Das K.C., White C.W.: Redox system of the cell: possible links and implications. Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99: 9617-9618.

3.     Niki E.: Lipid peroxidation products as oxidative stress biomarkers. Biofactors 2008; 34 (2): 171-180.

4.     Esterbauer H., Schaur R.J., Zollner H.: Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Rad Biol Med 1991; 11: 81-128.

5.     Blair I.A.: Lipid hydroperoxide-mediated DNA damage. Exper Geront 2001; 36: 1473-1481.

6.     Marnett L.J.: Oxy radicals, lipid peroxidation and DNA damage. Toxicology 2002; 181/182: 219-222.

7.     Gaweł S., Wardas M., Niedworok E., Wardas P.: Dialdehyd malonowy (MDA) jako wskaźnik procesów peroksydacji lipidów w organizmie. Wiad Lek 2004; 57: 456-461.

8.     Valko M., Izakovic M., Mazur M., Rhodes C.J. Telser J.: Role oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. Mol Cell Biochem 2004; 266: 37-56.

9.     Hussain S.P., Hofseth L.J., Harris C.C: Radical causes of cancer. Nat Rev Cancer 2003; 3: 276-285.

10.     Dąbrowski A., Gabrylewicz A.: Wolne rodniki tlenowe w chorobach układu pokarmowego. Press Med 2000; 6: 4-8.

11.     Shacter E., Weitzman S.A.: Chronic inflammation and cancer. Oncology 2002; 6 (2): 217-232.

12.     Bartsch H., Nair J.: Oxidative stress and lipid peroxidation-derived DNA-lesions in inflammation driven carcinogenesis. Cancer Detect Prevent 2004; 28: 385-391.

13.     Ohkawa H., Ohishi N., Yagi K.: Assay for lipid peroxides in animal tissues by thiobarbituric acid reaction. Anal Biochem 1979; 95: 351-358.

14.     Krawczyk M.: Epidemiologia nowotworów złośliwych przewodu pokarmowego. [W:]  Nowotwory przewodu pokarmowego. Wyd. Lekarskie PZWL, Warszawa 2001: 4-24.

15.     Gonenc A., Ozkan Y., Torun M., Simsek B.: Plasma malondialdehyde (MDA) levels in breast and lung cancer patients. J Clin Pharm Ther 2001; 26: 141-144.

16.     Bakan E., Taysi S., Polat M.F., Dalga S., Umudum Z., Bakan N., Gumus M.: Nitric oxide levels and lipid peroxidation in plasma of patients with gastric cancer. Jpn J Clin Oncol 2002;  32: 162-166.

17.    Bianchi G., Marchesini G., Fahrbi A.: Lipoperoxide plasma levels in patients with liver cirrchosis. Hepato-Gastroenterol 1997; 44: 784-788.

18.     Niederhofer L.J., Daniels J.S., Rauzer C.A., Greene R.E., Marnett L.J.:  Malondialdehyde, a product of lipid peroxidation is mutagenic in human cells. J Biol Chem 2003; 278: 31426-31433.

19.     Inal M.E., Kanbak G., Sunal E.: Antioxidant enzyme activities and malondialdehyde levels  related to aging. Clin Chim Acta 2001; 305 (1-20): 75-80.

20.     Wiśniewska J., Wieczorkowska-Tobis K., Korybalska K., Połubińska A., Simon M., Bręborowicz A.: Ocena aktywności enzymów antyoksydacyjnych u osób w wieku podeszłym. Gerontolog Pol 1999; 7: 27-32.

21.     Skrzydlewska E., Sulkowski S., Koda M., Zalewski B., Kanczuga-Koda L.: Lipid peroxidation and antioxidant status in colorectal cancer. World J Gastroenterol 2005; 11: 403-406.

22.     Reddy E.P., Reddy V.S., Chandra Mouli K., Rao P.V.L.N.S.: Physiologic antioxidant system and oxidative stress in stomach cancer patients with normal renal and hepatic function. Online J Health Allied Sci 2009; 8(4): 9-15.  

23.     Nayak B.S., Pinto S.: Protein thiols and thiobarbituric acid reactive substance staus in colon cancer patients. Scand J Gastroenterol 2007; 42 (7): 848-851.

24.     Nishikawa M.: Reactive oxygen species in tumor metastasis. Cancer Lett 2008; 266: 53-59.

25.     Chang D., Wang F., Zhao Y.S., Pan H.Z.: Evaluation of oxidative stress in colorectal cancer patients. Biomed Environ Sci 2008; 21 (4): 286-289.

..............................................................................................................................................................

*Adres do korespondencji

Hanna Czeczot
Katedra i Zakład Biochemii  
Warszawski Uniwersytet Medyczny
02-097 Warszawa, ul. Banacha 1
tel.: 22 572 06 93
e-mail: hanna.czeczot@wp.pl

Pracę nadesłano: 10.12.2009 r.
Przyjęto do druku: 14.06.2010 r.