WSTĘP

W laboratoriach, jako zwierzę doświadczalne, szczur (obok myszy) okazał się zwierzęciem wręcz niezbędnym. To właśnie dzięki szczurom dokonano i dokonuje się nadal wiele bezcennych dla ludzkości odkryć naukowych. Obecnie zwierzęta te stanowią około 15% wszystkich zwierząt laboratoryjnych. W Polsce do badań najczęściej wykorzystuje się szczep Wistar oraz szczury nieszczepowe, będące krzyżówkami międzyszczepowymi [1].

Obecnie stosowanie zwierzęcych, biologicznych modeli chorób, które występują u człowieka, to jedna z ważniejszych dziedzin nauk medycznych. Dzięki tym technikom nastąpił rozwój farmakologii, immunologii, cytogenetyki oraz onkologii. Spowodowało to także lepsze zrozumienie patogenezy chorób spowodowanych niewłaściwym żywieniem czy skażeniem środowiska. Dlatego też wykrywanie nowych modeli chorób charakterystycznych dla człowieka ma ogromne znaczenie poznawcze. W obecnych czasach istnieje tendencja do opracowywania modeli zwierzęcych wszystkich chorób występujących u człowieka [2].

Natomiast jeśli chodzi o mechanizmy oddziaływań oksysteroli, które obejmują szerokie spektrum złożonych aktywności biologicznych na poziomie komórkowym, ustalono je do tej pory głównie na podstawie badań in vitro. Dlatego też istotnym wydaje się fakt rozszerzenia tych obserwacji o badania in vivo.

Wątroba odgrywa jedną z głównych ról w metabolizmie ustrojowym, spełniając różnorodne funkcje biologiczne. Jednak i tak podstawową jednostką morfologiczną jest zrazik wątrobowy o kształcie wielobocznej piramidy [3, 4, 5]. Wątroba zwierząt doświadczalnych wykazuje znaczące właściwości regeneracyjne [6]. Odbudowa po uszkodzeniu czynnikami toksycznymi nie jest jednak pełna. Często dochodzi do nadmiernego rozwoju tkanki łącznej, utrudniającego lub uniemożliwiającego regenerację hepatocytów oraz odtworzenie prawidłowego układu przestrzennego między hepatocytami, naczyniami krwionośnymi i przewodami żółciowymi. Podczas odbudowy dochodzi również do intensywnej proliferacji komórek budujących naczynia krwionośne. Wykazano również, iż w odbudowaniu wątroby bierze udział cholesterol, który jest obecny w chromatynie regenerujących się i rozprzestrzeniających się komórek [7]. Ciężkie urazy wątroby, powodujące jej niezdolność do odtruwania organizmu, nowotwory i wady wrodzone mogą doprowadzić do zgonu [8].

Peroksydacja (autooksydacja) lipidów, które są narażone na wpływ tlenu, przyczynia się nie tylko do psucia się żywności (jełczenia), ale również powoduje uszkodzenie tkanek in vivo, co z kolei prowadzić może do odczynów zapalnych, nowotworów, miażdżycy, czy starzenia się. Szkodliwe działania są zapoczątkowywane przez wolne rodniki powstające podczas tworzenia nadtlenków kwasów tłuszczowych, które posiadają podwójne wiązania oddzielone grupą metylenową, czyli te znajdujące się w naturalnych wielonienasyconych kwasach tłuszczowych [9]. Główną rolę w toksyczności tego pierwiastka odgrywa powstawanie w komórkach reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS). A potencjalnymi źródłami ROS są hepatocyty oraz komórki Kupffera [10].

Jedną z konsekwencji wzmożonego narażenia komórek na ROS – czyli stresu oksydacyjnego – jest obniżenie poziomu ATP. Ma on wpływ również na funkcje błony plazmatycznej, zwiększając jej przepuszczalność i powodując obniżenie różnicy potencjału elektrycznego między wnętrzem komórki a środowiskiem pozakomórkowym. Działaniem stresu oksydacyjnego może być również uszkodzenie cytoszkieletu i zmiany morfologiczne powierzchni komórek. Natomiast ostateczną konsekwencją może być uszkodzenie DNA.

Jednym z procesów, w którym istotną rolę odgrywają reaktywne formy tlenu, jest programowana śmierć komórki, czyli apoptoza. Reaktywne formy tlenu mogą powodować uszkodzenia komórki inicjujące apoptozę bądź być sygnałem do jej inicjacji. Również stres oksydacyjny, spowodowany osłabieniem mechanizmów antyoksydacyjnych komórek, może wywołać indukcję apoptozy [11].

Oksysterole wykrywane w organizmach zwierzęcych mogą pochodzić ze spożywanej żywności oraz powstawać in vivo w wyniku wolnorodnikowych lub enzymatycznych przemian cholesterolu [8, 12]. Na podstawie silnych efektów biologicznych, głównie badanych in vitro, oksysterole odgrywają ważną rolę w związku z obrotem cholesterolu, miażdżycą, apoptozą, nekrozą, zapaleniem, immunosupresją oraz rozwojem kamieni żółciowych [12].

Celem prezentowanej pracy jest ocena wpływu utlenionych pochodnych cholesterolu na powierzchnię całkowitą wybranych składników komórkowych, jak i całych hepatocytów szczurzych w warunkach in vivo. Realizacja celu pracy obejmuje ocenę powierzchni całkowitej: komórki, jądra komórkowego oraz cytoplazmy w okolicach żyły centralnej oraz triady wątrobowej.

MATERIAŁ I METODY

Szczury szczepu Wistar (samce o początkowej masie ciała 150-200 g) pochodziły z hodowli Centralnej Zwierzętarni Doświadczalnej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach. W trakcie doświadczenia przebywały pojedynczo w standardowych klatkach dla gryzoni wyściełanych trocinami, w pomieszczeniu o temperaturze 20-25oC, z oświetleniem sztucznym (cykl dzień/noc – 12h/12h). Pasza podawana była raz dziennie ad libitum. Zwierzęta pojone były wodą destylowaną ad libitum. Przed rozpoczęciem właściwego doświadczenia, zwierzęta przebywały 2-tygodniowy okres aklimatyzacji w opisanych powyżej warunkach.

Część badawcza pracy uzyskała akceptację Lokalnej Komisji Etycznej ds. Doświadczeń na Zwierzętach przy SUM (opinia nr 2/04 z dnia 13.01.2004) oraz stanowi element projektu badań prowadzonych przy Katedrze Ogólnej Biologii Lekarskiej w Zabrzu.

Szczury podzielone na 2 grupy otrzymywały:

• grupa A – paszę bez dodatków oksysteroli. Spożycie paszy i wody destylowanej ad libitum.

• grupa B – paszę zawierającą dodatek octanu 5a,6a-epoksycholesterolu w stężeniu 100 mg/kg paszy. Spożycie paszy i wody destylowanej ad libitum.

Dzienne dawki oksysteroli oszacowano na 10 mg/kg m.c. zwierzęcia/dobę (przy dobowym spożyciu paszy wynoszącej 10% masy ciała zwierzęcia). W badaniach stosowano standardową, bytową paszę laboratoryjną dla gryzoni Labofeed B produkcji Wytwórni Pasz w Kcyni. Wzbogacenia paszy w utlenione pochodne steroli dokonano przez spryskanie jej roztworem oksysteroli w mieszaninie eteru naftowego i acetonu (1:1, v/v) i odparowanie rozpuszczalników w temperaturze 37oC pod zmniejszonym ciśnieniem (suszarka próżniowa, 12 godzin) w celu uniknięcia ewentualnej dalszej oksydacji steroli naturalnie zawartych w paszy. Przygotowana pasza przechowywana była w temperaturze -20oC do momentu podania zwierzętom (maksymalnie 21 dni). Okres skarmiania paszy wynosił 90 dni. Zwierzęta ważono przed i po zakończeniu doświadczenia.

Po okresie 3 miesięcy zwierzęta znieczulano mieszaniną ketaminy, droperidolu i fentanylu, stosując dawki odpowiednio: 50 mg/kg m.c. (im), 0,1 mg/kg m.c. (im) i 100 mg/kg m.c. (im) i uśmiercono przez pobranie krwi z serca, a następnie dyslokację szyjnego odcinka rdzenia kręgowego. Ze zwłok pobierano wątrobę, a następnie ją ważono. Do badań morfologicznych zabezpieczono wycinek wątroby, umieszczając materiał w odpowiednim płynie utrwalającym.

Tkankę płukano zbuforowanym 0,9% roztworem soli fizjologicznej (PBS – fosforan sodowy, pH 7.4; 10 mM), a następnie utrwalano w zbuforowanej 4% formalinie (24h, 4°C). Kolejnym etapem pracy było wykonanie preparatów mikroskopowych wątroby szczurzej używając standardowego barwienia H/E (ang. hematoxylin and eosin stain).

Do akwizycji obrazów posłużył mikroskop Nikon Eclipse E600 sprzężony z kamerą telewizyjną Panasonic (GP–KR222E). Akwizycji poddawano obrazy komórek parenchymalnych wątroby zlokalizowane w otoczeniu żył centralnych i triad. Obrazy pozyskiwano przy powiększeniu całkowitym 400 x i zapisywano w formacie TIFF (ang. Tagged Image File Format). Zapisane obrazy komórek poddawano pomiarom morfometrycznym. W każdym preparacie analizom poddano 222 hepatocyty otaczające 10 żył centralnych oraz 222 hepatocyty znajdujące się wokół 10 triad.

Podczas analizy wzięto pod uwagę następujące parametry: powierzchnię całkowitą komórki, jądra oraz cytoplazmy [13].

WYNIKI

Rezultaty otrzymane w trzech seriach były porównywane metodą analizy wariancji (ANOVA), testu F przy wykorzystaniu programu Microsoft Excel. Wyniki uznano za istotne statystycznie przy p≤0,05. Otrzymane w trakcie badań wyniki parametrów morfologicznych przedstawiono na kolejnych, występujących po sobie rycinach, uwzględniając położenie hepatocytów – żyła centralna lub triada wątrobowa. We wszystkich przypadkach, jak widać na rycinach 1-3, doszło do zmniejszenia się wybranych parametrów w rejonie triady wątrobowej i żyły centralnej. Mamy więc do czynienia z mniejszymi wartościami w przypadku powierzchni komórki (ryc. 1), jądra (ryc. 2) czy cytoplazmy (ryc. 3).

DYSKUSJA

Wielu autorów zwraca uwagę na udział oksysteroli w procesach patologicznych. Na przykład Björkhem i wsp. [14, 15] zaobserwowali, iż oksysterole mają związek z aterogenezą, apoptozą, nekrozą, zapaleniem, immunosupresją czy tworzeniem kamieni żółciowych. Tezę tę potwierdzają również Sottero i wsp., którzy upatrują w metabolitach cholesterolu przyczynę powstawania i postępu takich chorób przewlekłych jak: miażdżyca, procesy neurodegeneracyjne, cukrzyca czy uszkodzenie nerek [16]. Chmielewski i wsp. [17] wykazali, że wśród czynników mających destrukcyjny wpływ na wątrobę ważną rolę mogą odgrywać utlenione lipidy, biorące udział w niebezpiecznym dla komórek wątroby, a także całego organizmu stresie tlenowym. Wytwarza się wówczas duża ilość rodników tlenowych poprzez indukcję cytochromu P-450 2E1. Te wolne rodniki doprowadzają do uszkodzenia komórki i są substancjami indukującymi apoptozę. Gujral i wsp. [18] w swoich badaniach zaobserwowali kurczenie się komórek, kondensację chromatyny oraz obecność ciałek apoptotycznych jako efekt działania oksysteroli. Wyniki otrzymane w prezentowanej pracy potwierdzają te hipotezy, ponieważ pomiary morfometryczne otrzymane dla komórek zlokalizowanych zarówno w okołowrotnych, jak i okołocentralnych obszarach wątroby wskazują na zmniejszenie powierzchni zarówno hepatocytów, jak i jąder czy samej cytoplazmy tych komórek.

Ryan i wsp. [19] sugerują, że oksysterole – jako związki pochodzenia endogennego lub egzogennego (z diety) – mogą posiadać różnoraką biologiczną aktywność. Jakkolwiek ich badania skupiają się przede wszystkim na wpływie tych związków na rozwój miażdżycy oraz indukcję apoptozy komórek w blaszce miażdżycowej, co stanowi początkowy etap rozwoju tego procesu patologicznego. Komórki apoptotyczne są opisywane jako wykazujące kondensację chromatyny i/lub fragmentacje jądra. Zmiany własności morfologicznych komórek pod wpływem oksysteroli wykazali również Seo i wsp. [20]. Zaobserwowany efekt działania tych związków tłumaczony jest ich silną cytotoksycznością w stosunku do komórek różnych typów. Badania przeprowadzone przez Seo i wsp. potwierdzają obserwacje uzyskane w prezentowanej pracy, jak również obserwacje pochodzące z wielu innych doniesień, tj. zmniejszenie pola powierzchni profilu komórki czy jądra komórkowego przemawiające za kondensacją tych parametrów komórkowych.

W badaniach Seo i wsp. zwrócono także uwagę na szerokie spektrum innych właściwości biologicznych oksysteroli, do których należy: regulacja syntezy cholesterolu, wpływ na strukturę lipidowej składowej błon komórek oraz zmiany aktywności enzymów związanych z błoną komórkową. Ponadto, autorzy podkreślają, iż oksysterole są obecne w ludzkich blaszkach miażdżycowych oraz mogą wywołać reakcję zapalną w komórkach śródbłonka, monocytach i makrofagach. Seo i wsp. sugerują również, iż oksysterole mogą mieć wpływ na fizjologię komórek śródbłonka żółciowego i powiązane z tym choroby dróg żółciowych, tj. zapalenie, formowanie kamieni żółciowych czy kancerogenezę.

Wielkoszyński i wsp. [21] donoszą, że znaczne ilości oksysteroli można wykryć w tkankach nowotworowych oraz w wydzielinach pochodzących z tkanek objętych procesem nowotworowym, np. w aspiracie uzyskanym z nowotworowo zmienionego sutka czy gruczołu krokowego. Oksysterole mogą również występować w guzach jelita grubego oraz skóry. Van Reyk i wsp. [22], również traktując oksysterole jako 27-węglowe produkty utleniania cholesterolu na drodze enzymatycznej lub nieenzymatycznej, potwierdzili ich działanie aterogenne. Wspominają także, iż istnieje wiele ważnych oddziaływań pod względem fizjologicznych i patologicznych właściwości oraz funkcji różnego typu oksysteroli. Dochodzą również do wniosku, że kilka oksysteroli może być związanych z kontrolą lipidowego metabolizmu czy genową transkrypcją. Badania Björkhema i wsp. [14] również wskazują na działanie aterogenne oksysteroli. W badaniach tych stwierdzono, że oksysterolem o najwyższym stopniu cytotoksyczności wydaje się być 7-hydroperoksy-cholesterol, natomiast we krwi pacjentów z miażdżycą stwierdza się częściej niż u osób zdrowych podwyższone poziomy 27-hydroksycholesterolu. Z kolei obecność w krążeniu oksysterolu specyficznego dla mózgu, tj. 24-hydroksycholesterolu, otwiera nowe możliwości by zbadać zmiany w homeostazie cholesterolu w mózgu w różnych warunkach: fizjologicznych, farmakologicznych czy patologicznych.

Leonarduzzi i wsp. [23] oraz Leoni i wsp. [24] zauważają, iż znaczące frakcje cholesterolu, które kumulują się w przypadku miażdżycy, czyli tzw. oksysterole, posiadają wiele silnych biochemicznych właściwości mogących prowadzić m.in. do apoptozy. Jako przykład podają gromadzenie się oksysteroli w wielu przewlekłych chorobach, włączając dość często opisywane choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera czy stwardnienie rozsiane [12, 15, 25]. Wykazano, że oksysterole mogą funkcjonować również jako cząstki regulatorowe pewnych procesów zachodzących w organizmie. Roli takiej upatruje się w stosunku do ich wpływu na mezenchymalne komórki macierzyste, na przykład Kha i wsp. [26] donoszą, że istnieje możliwość modulacji komórek pnia w komórki kościotwórcze, np. przez pewne oksysterole – 22-hydroksycholesterol i 20-hydroksycholesterol. Ten efekt może mieć decydujące znaczenie w przypadku ostatnio dość często występującej w populacji osteoporozy.

Oksysterole wykazują szerokie spektrum właściwości biologicznych. W przypadku cytotoksyczności oksysteroli istnieje kilka mechanizmów, na które mają wpływ, np.: zahamowanie aktywności reduktazy HMG-CoA, działanie antyproliferacyjne, indukcja apoptozy, wymiana cholesterolu przez oksysterole w błonie, która pociąga za sobą zmiany w strukturze i funkcjonowaniu błony komórkowej oraz wpływ na przebudowę układu opornościowego. Stwierdziliśmy to także w naszych badaniach, analizując kolejno wybrane przez nas parametry i zauważając znaczący wpływ oksysteroli na wielkość nie tylko samej komórki, ale również jądra czy powierzchni cytoplazmy. We wszystkich badanych przez nas grupach mieliśmy do czynienia ze zmniejszonymi wartościami tych parametrów, co może potwierdzać rozpoczęcie procesu apoptozy w badanych komórkach. Ponadto, ROS mogą mieć działanie mutagenne i rakotwórcze oraz mogą służyć jako wewnątrzkomórkowe sygnalizacyjne czy regulacyjne cząsteczki. Efekt działania antyproliferacyjnego oraz indukcja apoptozy przez oksysterole może mieć znaczenie w przypadku tak ważnej obecnie dziedziny, jaką jest onkologia. Co więcej, działanie cytotoksyczne oksysteroli może być przydatne w leczeniu przeciwbakteryjnym i przeciwgrzybiczym. Ponadto, w efekcie wieloletnich badań doświadczalnych oksysterole budzą zainteresowanie badaczy, szczególnie tych interesujących się biologią molekularną, z powodu wpływu tych związków na sygnał transdukcji [27]. Na podstawie przeprowadzonych doświadczeń można stwierdzić, że oksysterole w badaniach in vitro oraz in vivo wykazują częste działania cytotoksyczne oraz potencjalnie aterogenne. Efekt cytotoksyczny to głównie zahamowanie wzrostu komórek w hodowlach tkankowych oraz opóźnianie wzrostu zwierząt doświadczalnych [14]. Z drugiej jednak strony oksysterole mogą też regulować przekaźnictwo wewnątrz- i międzykomórkowe oraz wpływać na istotne dla każdej komórki procesy, jak np. biosyntezę cholesterolu [21]. Zauważono również, że oksysterole mogą modyfikować proces fizjologicznej, zaprogramowanej śmierci hepatocytów [11, 14, 17, 28].

WNIOSKI

W efekcie przeprowadzonych badań i analiz otrzymanych wyników można wysunąć następujące wnioski:

1. Oksysterole obecne w pokarmie wywarły wpływ na morfologię komórek miąższowych wątroby w obydwu obszarach czynnościowych miąższu – zarówno w obrębie triady wątrobowej, jak i w okolicach żyły centralnej. Substancje te doprowadziły do zmniejszenia takich parametrów jak powierzchnia komórki, cytoplazmy czy jądra.

2. Dalsze badania wpływu tych związków na funkcjonowanie komórek in vivo wydają się być istotne dla wyjaśnienia mechanizmów ich oddziaływań cytotoksycznych, co ma znaczenie w przypadku wielu zmian patologicznych dotyczących wątroby.

3. Komputerowa analiza obrazu jest metodą przydatną do oceny wpływu oksysteroli na tkankę wątrobową i może być stosowana pod innym kątem jeśli chodzi o badania morfometryczne.

4. Wydaje się, iż ze względu na oddziaływanie oksysteroli nie tylko na cały organizm, ale również na pojedyncze komórki, należy przyjrzeć się bliżej czynnikom modulującym aktywność oksysteroli, aby zrozumieć ich kliniczną i leczniczą wrażliwość. W celu wyjaśnienia tych mechanizmów potrzebne są badania poziomu oksysteroli zarówno w surowicy krwi, jak i w tkankach czy innych materiałach biologicznych.

..............................................................................................................................................................

PIŚMIENNICTWO

1.     Gorazdowski MJ: Szczury. Wydawnictwo Spółdzielcze, Warszawa 1992.

2.     Brylińska J, Kwiatkowska J: Zwierzęta laboratoryjne. UNIVERSITAS, Kraków 1996.

3.     Beck B: Współczesne poglądy na proces włóknienia wątroby. Diagn Lab 2005; 41: 95-106.

4.     Sawicki W: Histologia. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2003.

5.     Traczyk WZ: Diagnostyka czynnościowa człowieka. Fizjologia stosowana. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1999.

6.     Zabel M: Histologia. Wydawnictwo Urban & Partner, Wrocław 2000.

7.     Albi E, Magni MV: The presence and the role of chromatin cholesterol in rat liver regeneration. J Hepatol 2002; 36 (3): 395-400.

8.     Olkkonen VM, Lehto M: Oxysterols and oxysterol binding proteins: role in lipid metabolism and artherosclerosis. Ann Med 2004; 36 (8): 562-572.

9.     Rodwell VW: Białka: struktura i właściwości. [W:] Biochemia Harpera. Red. Murray RK i wsp. Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002: 354-363.

10.     Friedman SL: Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury. J Biol Chem 2000; 275: 2247-2250.

11.     Jaeschke H i wsp.: Mechanisms of hepatotoxicity. Toxicol Sci 2002; 65: 166-176.

12.     Björkhem I, Diczfalusy U: Oxysterols: friends, foes or just fellow passengers? Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002; 22: 734-742.

13.     Zieliński KW, Strzelecki M: Komputerowa analiza obrazu biomedycznego. Wstęp do morfometrii i patologii ilościowej. Wydawnictwo PWN, Warszawa 2002.

14.     Björkhem I: Do oxysterols control cholesterol homeostasis? J Clin Invest 2002; 110: 725-730.

15.     Björkhem I: Crossing the barrier: oxysterols as cholesterol transporters and metabolic modulators in the brain. J Intern Med 2006; 260: 493-508.

16.     Sottero B i wsp.: Cholesterol oxidation products and disease: an emerging topic of interest in medicinal chemistry. Curr Med Chem 2009; 16 (6): 685-705.

17.     Chmielewski M i wsp.: Apoptoza w wątrobie. Gastroenterol Pol 2003; 10 (5): 453-462.

18.     Gujral JS i wsp.: Mechanism of cell death during warm hepatic ischemia – reperfusion in rats: apoptosis or necrosis. Hepatology 2001; 33: 397-405.

19.     Ryan L, O’Callaghan YC, O’Brien NM: The role of the mitochondria in apoptosis induced by 7b-hydroxycholesterol and cholesterol-5b,6b-epoxide. Brit J Nutr 2005; 94: 519-525.

20.     Seo DW i wsp.: Oxysterols from human bile induce apoptosis of canine gallbladder epithelial cells i monolayer culture. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2004; 287: 1247-1256.

21.     Wielkoszyński T: Utlenione pochodne cholesterolu – oksysterole cz. II. Czynn Ryz 2003; 2-4: 39-47.

22.     van Reyk DM i wsp.: Oxysterols in biological systems: sources, metabolism and pathophysiological relevance. Redox Rep 2006, 11 (6): 255-262.

23.     Leonarduzzi G i wsp.: Activation of the mitochondrial pathway of apoptosis by oxysterols. Front Biosci 2007; 1 (12): 791-799.

24.     Leoni V: Oxysterols as markers of neurological disease – a review. Scand J Clin Lab Invest 2009; 69 (1): 22-25.

25.     Björkhem I, Meaney S: Brain cholesterol: long secret life behind a barrier. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 806-815.

26.     Kha HT i wsp.: Oxysterols regulate differentiation of mesenchymal stem cells: pro-bone and anti-fat. J Bone Miner Res 2004; 19: 830-840.

27.     Wielkoszyński T i wsp.: Cellular toxicity of oxycholesterols. Bioessays 2006; 28: 387-398.

28.     Schroepfer GJ: Oxysterols: modulator of cholesterol metabolism and other processes. Physiol Rev 2000; 80: 361-554.

..............................................................................................................................................................

*ADRES DO KORESPONDENCJI:

Anna Mazur
Katedra i Zakład Ogólnej Biologii Lekarskiej
41-808 Zabrze, ul. Jordana 19

Pracę nadesłano: 28.10.2010 r.
Przyjęto do druku: 11.12.2010 r.

Praca powstała na podstawie referatu wygłoszonego podczas XVII Zjazdu Polskiego Towarzystwa Diagnostyki Laboratoryjnej w Wiśle, 14-17.09.2010 r.